代谢组学样本收集

样本收集是代谢组学研究的第一步，是保障代谢组学研究结果可靠性的最重要的环节之一。根据不同的研究目的该选取何种生物样本？不同种类的生物样本的规范收集流程是什么？有哪些注意事项（抗凝剂、冻融、抑菌剂等使用细节）？如何保存生物样本？可保存多久等等？这些都是代谢组学实验中小伙伴经常咨询的问题，本文将针对以上常见问题作出系列总结归纳。

 

一.选择什么生物样本类型开展临床代谢组学实验？

代谢组学研究文献中已报道的样本类型种类繁多，如血（血清、血浆、全血）、尿、组织、粪便、细胞、脑脊液、淋巴液、唾液、羊水和胆汁等等[1]。选择何种类型的样本开展实验，取决于课题的研究目的和检测目标。无创或微创方式可采集的样本如血、唾液、尿、粪便等生物样品广泛用于临床诊断的生物标志物发现和验证，这种方式采样便于临床转化和推广。组织和细胞样品常常用于探索和解释疾病的病理机制研究。

在临床上，通过手术相对易于获得癌组织且样品量可以保障，但是，初诊患者一般是通过穿刺来确诊，其组织样本量极少，而且很多疾病的诊断过程无法获得组织样品，因此，一般而言我们可先采用患者的血液或尿液进行探索研究，再从动物和细胞水平加以验证。体外细胞的优势是我们可干预细胞的生存环境或遗传因子（基因、蛋白），常用于后期的生物学验证。

另外，根据不同的检测目标选取不同类型的生物样本。比如检测菌群相关代谢物，优先选择粪便或肠道内容物样本、口腔粘膜等样品。

 

二.选用血清还是血浆？

血清和血浆样本都被广泛用于代谢组学研究，整体而言，血清和血浆的代谢物种类差异不大，但是多数代谢物在两种样本中浓度差异较大。如下图1所示，无论是液质平台（正负离子检测模式，图1-A,B），还是气质平台（下图1-C,D），血清和血浆样本在PCA等模型得分图上都有明显区分[2, 3]。相比于血浆，血清中溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、氨基酸和葡萄糖等代谢物显著升高，而丙酮酸、柠檬酸、尿酸和磷脂酰肌醇则显著降低[4]。因此，对于同一个研究项目而言，我们选择同一类型的血液样本（血清或血浆）。另外，从图1-D可发现，血清和血浆的代谢轮廓会随着孵化时间的不同而改变。这提示我们要确保样本收集过程的一致性。由于血清样本需要时间去凝结，尤其要注意尽可能保证所有样品凝血时间的一致性。

图1. 血清和血浆样品PCA（A,B,C）和PLS-DA（D）得分图。

代谢组学关注的是不同个体间代谢轮廓的差异性。那么，血清和血浆本身的差异是否会影响个体间的代谢轮廓？下图是将血清和血浆分别作PCA得分叠加图，从图上可以看出个体间的相对位置较为类似。对血清和血浆样本得分值作Mantel test，ESI+和ESI-模式下的相关性分别为0.72和0.88[2]。因此，血清和血浆样本均可应用于代谢组学研究，只是找出的差异生物标志物会有细微的区别。

 

图2. 血清和血浆样品分别作PCA后的叠加得分图。

 

三.如何选择血浆抗凝？

血浆是血液经抗凝、离心除去血细胞后得到的淡黄色液体。常用的抗凝剂有柠檬酸、EDTA和肝素盐等。其中，柠檬酸和EDTA是通过钙离子鳌合作用而抗凝，而肝素是通过激活抗凝血酶，抑制凝血因子而抗凝。代谢组学项目一般不建议选择柠檬酸作为抗凝剂，因为柠檬酸是机体内重要代谢通路——三羧酸循环的中间产物。而EDTA在NMR上会产生很强的噪音信号[5]。那肝素盐是否就是最佳的抗凝剂选择？有多篇报道表明肝素盐抗凝管会在液质上产生严重的干扰信号[2, 6]，如下图3所示,经鉴定，这些干扰是聚乙烯醇的信号，可能来自于抗凝管中的塑料。因此，若选择质谱作为代谢组学检测平台，我们推荐EDTA作为血浆抗凝剂。

 

图3. 肝素锂抗凝血浆的液质色谱图。

 

四.尿液收集是否需要加抑菌剂？

尿样收集具有无创和易于获得的优点，被广泛应用于代谢组学研究。由于尿液中细菌生长迅速，有些研究会在尿液中添加如硼酸和叠氮化钠等抑菌剂保护尿液样本不被污染。但这些外来化学试剂的添加不可避免地会对尿液中的代谢物产生不利影响[7]。抑菌剂并不能完全去除掉细菌，选择离心加微孔滤膜过滤的方式更佳[8]。另外，尿液样品在低于-25℃条件下储存时，添加抑菌剂和不加抑菌剂，样品的代谢轮廓没有差异[9]。因此，我们不建议在尿液样品中添加如叠氮化钠等抑菌剂。

 

五.存储条件对代谢物是否有影响？

样品长期存储于液氮中是最理想的存储方式，但是需要不断补充液氮，操作成本高。实验室中最常见的存储方式是-20℃和-80℃冰箱。那么这两种方式会对代谢物产生怎样的影响？Helen等对比了在-20 ℃和-80 ℃存储不同时间下生物样本中代谢物的稳定性[10]。如下图所示，经过长达6个月的存储以后，-20℃和-80℃存储的样品整体代谢轮廓较没有明显差异，且和收集当天较为类似。但部分代谢物如蛋氨酸、B族维生素、DHA和EPA在-20℃下存储3个月以上会发生显著降解[11,12]。因此，推荐将样品存储于-80℃冰箱，并尽快送检。如果检测物质是易挥发、易氧化降解的，建议开展预实验。

图4. 尿液样品PCA得分图。A：收集当天；B：1个月后；C：6个月后。空心的为-80℃存储，实心的为-20℃存储。

 

六.冻融对代谢物是否有影响？

环境温度及变化均会对生物体内的小分子代谢物产生影响。若将超低温冰箱或液氮中的生物样本直接放置到室温环境，代谢物氧化降解或代谢酶活性恢复的时间差异，会引起代谢物组成和浓度的变化。因此，代谢组学样本的解冻需要在冰浴上缓慢进行。

代谢组学样品应尽量避免反复冻融。Helen等人发现尿液经过九次冻融后，其代谢轮廓的差异相比个体差异（相同颜色代表同一个体）要小（图5）[10]。另一篇报道也发现冻融对生物样本的影响并没有我们想象的那么大，但对临床样本而言会有个体差异[6]。某些个体的样品较为稳定，而有些个体的样品即使经过一次冻融，其代谢轮廓也会发生剧烈波动（图6 A&B）。另外，不同代谢物种类对冻融的敏感度也不同，如肉碱经过两次冻融后，其浓度显著降低（图6 C）。因此，我们建议在存储前有计划地将样品提前分装好，尽量避免反复冻融。生物样本冻融不超过六次为宜，且需在低温下缓慢解冻。

 

图5. 六个临床尿液样品反复冻融九次后的PCA得分图。

 

图6. 冻融对代谢轮廓的影响。

 

小结

对于代谢组学检测，我们推荐血清样本或EDTA抗凝血浆样品，尿液样品建议不要添加抗菌剂。样品应当提前分装好，并置于-80℃冰箱存储，尽量避免反复冻融。

代谢组学粪便样本收集方法

1粪便样本的异质性

从下图中可以看出[1]，粪便收集器中不同位置取出的局部粪便样品和整体匀浆后的粪便样本（绿色）在PCA得分图上有较为明显的分布差异，且这种差异在不同个体之间是不一致的。相比于代谢物组，不同位置获得的菌群测序结果却差异不明显，为了方便存储，显然不可能把所有收集到的新鲜粪便冻存。因此，临床上冻存收集的新鲜粪便之前，需用无菌棒将样品混匀。

 

图1. 粪便不同部位代谢轮廓PCA图，来源文献[1]。

 

2样本的运输

临床上收集粪便样本，可能会碰到病人在自己家中采集粪便的情况。此时，如何将粪便运送至医院是需要考虑的事情。如下图所示，相比于5h、10h和24h，粪便在室温和冷藏条件下放置1h，其代谢轮廓与新鲜粪便更为接近。但单独比较新鲜粪便和放置1h后的粪便时可发现，室温可致乙酸和戊酸含量显著升高，而琥珀酸和富马酸含量显著降低。冷藏存储则较为稳定，其代谢物和新鲜粪便无明显差异[1]。因此，患者在家中采集的新鲜粪便需置于冰上，并在1-2小时之内送至医院。

图2. 室温和冷藏不同时间的PCA图，来源文献[1]。

 

3粪水和原始粪便样本的稳定性

除了直接冻存收集的新鲜粪便，另一种方式是按1:2（粪便：水）或其他比例加入水或PBS，振荡后，超速离心获得粪水，以粪水的形式存储。如下图所示，新鲜粪便在-20℃放置1h后，代谢轮廓即发生了较为明显的改变[1] 。冻存24h后粪水的代谢轮廓更稳定，和新鲜粪水没有明显差异，但粪水在室温下放置5h及冷藏下放置24h以上，代谢轮廓开始明显偏移[1]。需要指出的是，粪水样品对于检测疏水性强的化合物并不适合。另外，冻干粪便也是一种选择。一般200mg的新鲜粪便可获得约40mg的冻干粪便[2]。Lee等[3]对比了粪水和冻干粪便的差异，发现粪水中疏水性的长链醇、酯和甾醇类损失明显。冻干粪便亦有缺点，即冻干的过程会损失挥发性的代谢物，如SCFAs[4]。

图3.不同温度和时间存储粪便和粪水样本的PCA图，来源文献[1]。

 

4反复冻融的影响

如下图所示，冻融两次和三次的粪水样本和新鲜粪水样本在PCA图上存在明显区分，且可以分别和新鲜粪水样本建立稳健的OPLS-DA模型。反复冻融对氨基酸和尿苷有显著影响[1]。因此，粪便样本应当提前分装，避免反复冻融。

图4.不同冻融次数粪水样本的PCA图和差异代谢物，来源文献[1]。

 

肠道内容物

粪便反映的是整个肠道和宿主互作的最终结果，无法真实反映各个肠段的菌群活动。菌群分泌的某些代谢物可能只是作为“中间产物”会被宿主重新吸收加以利用，所以代谢物在各肠段的分布不尽相同。以胆汁酸为例，十二指肠和回肠中的胆汁酸以结合型胆汁酸为主，丰度分别可达97.8%和89.7%，而盲肠和直肠中以非结合型胆汁酸为主，丰度分别可达97.7%和97.5%[5]。因此，肠道内容物与粪便样本相结合，能让我们更全面地研究菌群和宿主之间互作的代谢关系。对于动物模型，肠道内容物易于获得，常被用于菌群代谢物的检测。菌群测序结果也显示粪便和各肠断的微生物相似度为0.7-0.9，并不能完全代表宿主各肠段微生物的真实情况[6]。

以各肠段名及粪便分别和16S作为关键词在Pubmed数据库上检索近五年的文章，搜索结果如下图所示。可以看出测序样本以粪便为主，肠道内容物则以结肠和盲肠为主，可能是因为结肠中微生物数量最为丰富，而盲肠因为相对封闭的环境，菌群较为稳定。代谢组学和测序是研究肠道菌群的两大利器，常被结合使用。因此，我们可以选择同一种样本，对菌群测序结果和代谢组学结果作关联分析，以深入挖掘菌群—宿主的互作机制。

图5. 近五年肠道内容物测序文章数量，数据来源Pubmed。

小结

粪便样本虽然无创易得，但基质复杂，我们需要尽量减少样本收集、存储和分析中引入的误差。

对于粪便样本的收集，我们需要注意以下几点：

（1）原始新鲜粪便需要混匀；

（2）如在家中收集，样本应置于冰上并在1-2h之内送至医院进行后续处理；

（3）粪便可以粪水结合粪便或冻干粪便的形式存储；

（4）提前分装，避免反复冻融。

对于动物实验，肠道内容物也是检测菌群代谢物的首选样本之一，目前研究较多的是结肠和盲肠。我们可以选择同一种肠道内容物，结合测序数据，作关联分析。

参考文献

1.Gratton, J., et al., Optimized Sample Handling Strategy for Metabolic Profiling of Human Feces. Anal Chem, 2016. 88(9):4661-8.

2.Ng, J.S., et al., Development of an untargeted metabolomics method for the analysis of human faecal samples using Cryptosporidium-infected samples. Mol Biochem Parasitol, 2012. 185(2):145-50.

3.Phua, L.C., et al., Global gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry (GC/TOFMS)-based metabonomic profiling of lyophilized human feces. Journal of Chromatography B, 2013. 937:103-113.

4.Saric, J., et al., Species variation in the fecal metabolome gives insight into differential gastrointestinal function. Journal of Proteome Research, 2008. 7:352-360.

5.Xie, G., et al., Alteration of bile acid metabolism in the rat induced by chronic ethanol consumption. Faseb J, 2013. 27(9):3583-93.

6.Wen-jing, Z., et al., Metagenomic Sequencing of Gut Microbiota along the Intestinal Tracts and Feces in Mice. Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural Science), 2016. 3:15-21.