微生物基因组改造技术和应用

原创： 安必奇生物 北京安必奇生物科技有限公司 1月12日

基因敲除的概念

基因敲除，又称为基因打靶，是一种基因工程技术，通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。基因敲除技术的优点是位点精确、成功率高，并且有很广泛的应用，可用于微生物、动植物的品种改良，创建生物膜性、疾病机理研究、免疫应用、精准医疗（遗传病的靶向治疗）等。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，现阶段技术比较成熟的有CRISPR/Cas9基因编辑技术。

微生物的基因敲除

在微生物领域，基因敲除除了可以用来进行菌种改良，还常常用来研究基因功能。微生物的基因组研究非常重要，微生物中的酶基因和代谢过程相关的功能基因，可能对整个现代生物科技、工业和农业发展都起到推动作用，比如抗生素的研发、工业用酶的发现、微生物发酵行业等。微生物基因敲除，常用的主要有两种方法，一种是基于同源重组系统，另一种是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术。

细菌基因组编辑技术

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同源重组系统

同源重组是指减数分裂或者有丝分裂的过程中，相同或者相似的DNA序列间发生交叉互换的现象。基于同源重组系统的微生物基因组编辑技术实验流程简单，利用限制性内切酶、连接酶和PCR技术等就可以对DNA片段或者质粒等基因组进行改造，实现基因敲除、敲入、突变等一系列修饰操作。

细菌基因敲除的传统方法是利用自身的Rec系统对外源进入的DNA进行同源重组，从而实现目标基因的等位替换。通过设计靶基因的同源融合片段，将其克隆至自杀载体中，自杀载体通过接合输入到靶细菌。通过抗生素筛选细菌基因组靶位点整合有自杀载体的插入突变株。在第二轮反向选择压力下，只有细菌基因组发生第二次同源重组并丢失自杀质粒的细菌才可以存活。最后通过PCR鉴定即可获得目的基因的缺失突变株。FLP重组酶机理基于Red同源重组技术敲除的技术路线

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CRISPR/Cas9基因编辑技术

CRISPR-Cas9作为先进的基因编辑技术，在微生物基因组改造方面有着明显的优势，该方法速度快，无痕，便于后续研究。需要重点提及的是CRISPR/Cas微生物基因敲入系统，它是在Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。同源性定向修复（HDR）途径，对比NHEJ修复途径，同源性定向修复（HDR）途径是更为精确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。这种Cas9 系统结合其它的基因工程技术，用于对基因组中目标DNA 进行改造，必将在生物、农业、环境研究及医学领域有着广泛的应用前景。

CRISPR/Cas9基因敲除。

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