原创： 微生太 微生态 2018-12-25

用于宏基因组测序分析的人类粪便样品取样方法

江舜尧 微生态 2017-06-29

一、样本筛选

1.如果受试者存在以下情况，则需剔除：

（1）5年内有过胃肠道大手术的（胆囊切除术和阑尾切除术）；

（2）有过主要肠道切除手术；

（3）炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎、克罗恩病（Crohn’s disease）或不确定的结肠炎；

（4）肠易激综合症（IBS）；

（5）持久性、传染性胃肠炎、结肠炎或胃炎;持续或慢性腹泻的病因不明，艰难梭状芽胞杆菌感染（复发）或幽门螺杆菌感染（未治疗）；

（6）慢性便秘；

（7）历史性的胃或肠道溃疡、胃肠道出血、腹痛、消化不良、胃肠里急后重（下坠）或排便困难，胃肠道或结肠息肉或包块或发育不良或癌症，以及腹泻或传染性胃肠炎；

（8）药物治疗记录：含碱式水杨酸铋， Pepto-Bismol， Kaopectate， Maalox Total Relief， Bismatrol， Pink Bismuth， Stomach Relief， Stress， Walgreens Soothe 和其它类似的铋碱式水杨酸盐的药物成分的药物。

2.对于存在历史性胃肠道疾病患者执行简单临床检查：腹部压痛、疼痛及肛门疾病。

二、准备材料

微生太^®粪便采集包一套：内含无菌粪便采集管三个，mark笔一支，一次性手套一双，自封袋一个；冰或冰袋或干冰，冰盒一个。

三、收集方法

1.自然排便法

（1）拆开微生太®粪便采集包，在采集管管壁和管盖以及自封袋上都写上样品名称（样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合，而且字符数大于3小于9）；

（2）排便前先排尽尿液，以免尿液污染；将马桶冲洗干净，排便在无水处，然后用取样勺挖取没有接触空气的粪便2g（1-2小勺），拧紧盖子，重复取3管，保存于自封袋；

（3）将自封袋放入冰盒，用冰或冰袋或干冰填埋，以制造低温环境，阻止菌群生长，2小时内保存到-80℃冰箱（如果是干冰填埋，只要在干冰挥发完之前送达即可）；

（4）所有样品收集完毕后，将每人三管中的一管粪便寄送到北京微生太科技有限公司实验室，进行宏基因组测序分析或菌群结构谱测序分析，寄送时需要干冰冷冻。

2.直肠拭子法

不易获得粪便时，可采用直肠拭子法采集。肥皂、水和 70%的酒精清洁肛门周围，将无菌拭子用生理盐水湿润后插入肛门 4～5cm(幼儿 2～3cm)，在肛门括约肌处轻柔的旋转，于肛门隐窝处取样，可在拭子上明显见到粪便，然后保存在无菌采样管。其他步骤参考“自然排便法”。

四、粪便微生物采样神器

Longsee粪便微生物基因组保护液套装外观

该套装尤其适合采集和保护粪菌样本。具有以下优点：（1）采集的样本在常温下放置14天，样本中菌群种类和丰度与新鲜样本的一致；（2）采集后样本可在常温下运输；（3）DNA的收获率高、完整性好、测序稳定性好。

用于菌群结构谱或宏基因组测序分析的实验动物肠道微生物取样方法

原创： 江舜尧 微生态 2017-06-30

一、准备材料

超净工作台，棉花，酒精，镊子；无菌冻存管， mark笔，一次性手套， 自封袋；冰或冰袋或干冰，冰盒。 以上是粪便收集方法中所用物品，如果取肠道内容物的话另外准备解剖剪等。

二、粪便收集方法

1. 超净工作台灭菌15分钟，通风5分钟，酒精擦拭工作台桌面（实在没有超净工作台就尽可能找洁净的场所，尽量避免外源菌污染）;


2. 在无菌冻存管管盖和管壁上都写上样品名称，注意，样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合，而且字符数不小于3且不大于9；

3. 腹部按摩法促使动物（以大鼠为例）在超净工作台排便，至少两粒粪便，每粒粪便保存在一个无菌冻存管中，其中一粒送给北京微生太科技有限公司（简称微生太），另一粒自己保存在-80℃冰箱备用；如果是小鼠，粪便粒数加倍，其他动物粪便量参考大鼠即可；

4.根据分组等情况，将冻存管保存在自封袋中，自封袋缓存在冰上，以避免菌群生长；

5.酒精擦拭工作台桌面，继续取样；

6.样品采集后2小时内保存到-80℃冰箱；

7.所有样品采集完毕后联系微生太取样。微生太将派送干冰到样品所在地，将样品放进派送干冰的泡沫盒，封严后交给物流师傅既可。 

 三、肠道内容物收集方法

其他步骤参考“粪便收集方法”，第三步参考方法如下：解剖动物腹部，取出肠道，剪开选定的肠段，挤出该肠段的肠道内容物于无菌冻存管中，体积至少相当于两粒大鼠粪便，混匀后分装成两管，其中一管送给微生太，另一管自己保存在-80℃冰箱备用。注意用酒精棉球和酒精灯灭菌后再取下一只动物的样品。

用于菌群结构谱或宏基因组测序分析的口腔微生物取样方法

原创： 江舜尧 微生态 2017-07-04

一、样本筛选

1、如果受试者存在以下情况，则需剔除。

（1）慢性口干；

（2）牙周袋≥ 4 mm；

（3）未处理的空洞龋病变或者口腔脓肿；

（4）癌前或癌损伤；

（5）念珠菌病；

（6）口臭；

（7）各种原因引起的牙齿缺失 8 颗牙齿以上者；

（8）多于 10%的探诊位点出血。

2、筛选过程需要专业的口腔检测设备及操作方式。

3、详细调查最近的口腔感染、炎症、脓疱、溃疡、良性或者恶性包块等口腔病史。并记录口腔预防或者牙周病治疗的时间长度。

4、完整的软组织检查，包块齿龈、口腔粘膜、舌、咽、扁桃体，并详细记录结果。

5、记录牙齿的数量，受试者应至少有 24 颗牙齿。

6、记录未处理的空洞性龋齿损伤和修复的牙齿的数量。

7、至少 6 项牙周检查，包括mesiofacial, midfacial, distofacial, mesiolingual, midlingual,distolingual.

8、牙周的检查应该包括完整的口腔，探诊深度、探针出血。

二、取样部位

主要包含唾液、软组织部分（舌背部、上颚、口腔粘膜、角质化的牙龈、腭扁桃体、咽喉）、坚硬部分（龈下牙菌斑和龈上的牙菌斑），各部位例图如下：

三、收集方法

1、唾液

（1）要求受试者保持唾液在口中持续至少 1min，然后吐到灭菌后的离心管中，为了保证收集到足够多的唾液（2-5ml），这个过程通常需要重复多次；

（2）唾液的产生可通过咀嚼天然原味口香糖进行刺激（1.0-1.5g）。受试者要有规律地咀嚼，当有足够的唾液时，吐到灭菌的离心管中，之后的步骤与 1 同；

（3）收集好灭菌管后，用自封袋封存，置于冰上，2h 内运输到实验室，-80°保存备用。

注意：在无菌管管盖和管壁上都写上样品名称，样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合，而且字符数不小于3且不大于9；下同。

2、软组织样本

所有的软组织样本都用拭子刮取。刮取后，立即在含有 750ul 的 MoBiobuffer 中涡旋。拭子上的海绵应该在离心管壁多按压几次，约 20s，以确保将细菌转移到 buffer 中。然后将buffer 在-80°冷冻保存备用。

（1）舌背部：刮取舌中心1cm²的部位，约 5s；

（2）上颚：刮取整个坚硬的上颚，约10s；

（3）口腔粘膜：刮取左侧和右侧的整个口腔粘膜区，每侧约10s，要注意不要接触到牙齿；

（4）角质化的牙龈：刮取颚前方的牙龈，约10s；

（5）腭扁桃体：分别刮取左侧和右侧的腭扁桃体5s；

（6）咽喉：由于条件反射，这个部位非常难收集，若需要取，建议取完别的部位后再取。慢慢地将拭子放入咽部后方，约 5s。注意不要刮到扁桃体。

3、坚硬部位样本

（1）龈上牙菌斑：记录牙菌斑取自哪颗牙齿，如臼齿，前臼齿，门牙。首先干燥即将取样的部位，其次用Gracey 刮匙刮取尽可能多的牙菌斑，最后将刮匙浸没到buffer 中，约 4-5s，将刮匙表面的物质都收集到灭菌管中。收集好灭菌管后，用自封袋封存，置于冰上，2h内运输到实验室，-80°保存备用；

（2）龈下牙菌斑：与龈上牙菌斑处理方式相同，需要注意要清除残留的龈上牙菌斑，并注意要丢弃有出血的样本。

用于菌群结构谱或宏基因组测序分析的人类鼻腔微生物取样方法

原创： 江舜尧 微生态 2017-07-05

一、样本筛选

1、如果受试者存在以下情况，则需剔除：

（1）样品采集当天，鼻腔佩戴饰品或其他金属，记录鼻腔穿刺情况；

（2）流感病毒疫苗注射后未满 28 天。

2、详细调查任何时间段患有的鼻窦炎、鼻炎、上呼吸道感染的病史，并记录疾病治疗的时间段，病史包括鼻部检查、鼻腔外科手术。

3、对鼻孔临床检查（特别是前鼻孔），检查鼻腔是否有炎症、息肉、包块、鼻涕等。

二、准备材料

2ml 无菌螺旋盖收集管（如MoBio 收集管）、750μ l样本收集液（如MoBio buffer）、Mark笔、无菌棉拭子、自封袋、一次性手套、碎冰或冰袋（最好是干冰）及冰盒。

三、收集方法

1、用Mark笔在收集管管壁和管盖上写上样品名称，样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合，而且字符数不小于3且不大于9；

2、利用无菌的棉拭子在鼻前孔黏膜层（约 2.5 cm 处）轻轻旋转式擦拭 2 次，蘸取黏膜上分泌物，缓慢抽出；

3、样本采集后应立即放入含有 750μ L MoBio buffer 的灭菌管中；棉拭子应多次按压管壁不少于 20 s，确保微生物从拭子转移到溶液中；左右鼻腔样本采集后，汇总成一个样本；

4、收集好收集管后，用自封袋封存，置于冰上，2h 内运输到实验室，-80℃保存备用。

备注：如果实在不方便购买保存液，可以将棉团剪下直接保存在没有保存液的保存管中，将保存管用冰或冰袋或干冰冷却，2h 内运输到实验室，-80℃保存备用。

四、注意事项

研究者采集样本时，应佩戴一次性无菌手套，避免接触实际采样区域及其周围区域；如果发生接触，手套可能被污染，应该立即更换手套。

用于菌群结构谱或宏基因组测序分析的人类阴道微生物采样方法

原创： 江舜尧 微生态 2017-07-07

一、志愿者筛选，排除以下志愿者

1. 有尿失禁者；
2. 子宫切除者；
3. 治疗过中毒性休克综合征者；
4. 5年前，患过宫颈或阴道非典型性增生者；

5. 两年前，被诊断有湿疣或人类乳头状瘤病毒（HPV）者；
6. 2个月前有患过念珠菌病，尿路感染或活跃性病（特别是衣原体、淋病、梅毒、生殖器疱疹、滴虫病）者；

7. 另外，记录阴道检查结果及 pH 检测结果，并且标本采集前，标本采集前 24-48h 禁欲、禁盆浴、禁阴道灌洗及局部上药，搜集月经期时间。

二、采样方法

1. 在无菌拭子管管盖和管壁上都写上样品名称，注意，样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合，而且字符数不小于3且不大于9；

2. 常规无菌操作消毒外阴或尿道口，用扩阴器扩张阴道；

3. 用无菌棉拭子拭取宫颈口或宫颈后穹窿的分泌物，不可碰及阴道壁，圆周滚动 5 次，放入无菌拭子管中（可不添加缓冲液），迅速放置在冰上或者直接存放在-80 摄氏度冰箱中备用。

三、人类阴道中常见菌群

主要的常住菌有乳杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、棱状杆菌、粪链球菌等。主要的过路菌有金黄色葡萄球菌、肠杆菌、丙酸杆菌、消化链球菌、韦荣球菌等。健康妇女阴道分泌物中，厌氧菌与需氧菌的比例为 5:1，活菌数为10²-10⁹/ml，菌数可达 8x 10⁷/ml，其中常住的真菌是假丝酵母菌；阴道毛滴虫属于过路原虫；常分离出疱疹病毒-2 型（HSV-2）和巨细胞病毒等。在正常阴道微生物群中，95%为乳酸杆菌。乳酸杆菌是妇女阴道内正常微生物群的优势菌，对阴道微生态平衡有明显的调节作用。

四、参考文献

1. Association of the Vaginal Microbiota with Human Papillomavirus Infection in a Korean Twin Cohort, 2013, Plos one.

2. Pregnancy’s Stronghold on the Vaginal Microbiome, 2013, Plos one.

3. Temporal Dynamics of the Human Vaginal Microbiota, 2012, Sci Transl Med.

4. Vaginal microbiome of reproductive-age women, 2010, PNAS.

用于菌群结构谱或宏基因组测序分析的皮肤微生物取样方法

江舜尧 微生态 2017-07-09

一、样本筛选

1、如果受试者存在以下情况，则需剔除：
（1）采样前7天，脸部，头皮，脖子，胳膊，前臂或者手使用过抗生素或者萜类物质者；

（2）脸部，胸部，背部或者肩膀有痤疮者；

（3）头皮，脸，脖子，手臂，前臂或者手上有水泡，脓疱，疮，脓肿，腐烂或者溃疡者；

（4）在4c²取样部位处有一处水泡，脓疱，疮，脓肿，腐烂，溃疡，藓，伤口，裂纹或者色素及粉红色的皮肤修复区者；

（5）身上有多处粉色或红色皮肤区域者（暗指牛皮癣或者湿疹患者）；

（6）手掌或者脚掌皮肤增厚或者有裂纹者；

（7）两周之内，每天使用去屑洗发水都不能清理干净头皮屑者；

（8）身体一处或者多处有散发型皮疹者。

2、志愿者的皮肤检查要在灯光良好情况下进行，并且要对全身有全面彻底的检查。

3、耳后的折痕（左右耳后面）和两个胳膊腋窝要仔细检查。

二、准备材料

1、无菌螺旋盖收集管（如 MoBio 收集管）；

2、无菌生理盐水；

3、标签纸；
4、Mark 笔和签字笔；

5、无菌脱脂棉签；

6、密封塑料袋；

7、-80°C冰箱；

8、一次性手套；

9、碎冰或冰袋，最好是干冰；

10、冰盒。

三、收集方法

1、在无菌拭子管管盖和管壁上都写上样品名称，注意，样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合，而且字符数不小于3且不大于9；

2、将无菌的脱脂棉签在无菌生理盐水中浸湿，在实验目的区域擦拭30s，擦拭面积4c²；

3、样本采集后应放入无菌螺旋盖收集管；收集好收集管后，用自封袋封存，置于冰上，2h 内运输到实验室，-80°C保存。

四、人类皮肤常见菌群

一类为常驻菌群，较固定地寄生于皮肤，数量和菌种的组成保持相对稳定；另一类为暂驻菌群，主要存在于暴露部位的皮肤，其数量和菌类有很大的变化。此外，还有一些微生物偶尔存在于少数人体上，称为偶存菌，仅在短时期内附着于皮肤和增殖，此受环境及常驻菌群活性的影响。常驻菌群寄生在角质层表面和表皮的最外层中。常见的有：微球菌科（包括凝固酶阴性葡萄球菌、类球菌、微球菌属），棒状微生物（包括棒状杆菌属、短颈细菌属），丙酸菌属，糠秕孢子菌属。

五、参考文献

1、Distinct cutaneous bacterial assemblages in a sampling of South American Amerindians and US residents, The ISME Journey, 2013.


2、Skin Microbiome Imbalance in Patients with STAT1/STAT3 Defects Impairs Innate Host Defense Responses, J Innate Immun, 2013. 

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微生态 2018-08-07

方法具体如下：

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