简而言之，染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来。如下图

染色质免疫沉淀技术示意图【王春雨， 石建党， 朱彦， et al。 染色质免疫沉淀技术在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用[J]。 遗传， 2005， 27(5):801-807。】

1、细胞的甲醛固定

甲醛是一种高分辨率的可逆的交联剂，能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联。其原理为#在甲醛的作用下，DNA碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的α氨基及赖氨酸-精氨酸-组氨酸-色氨酸的侧链氨基与另外的DNA和蛋白质上的氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布；而且，甲醛并不作用于游离的双链DNA，从而避免DNA的损伤。特别是，甲醛交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中分别对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度约为1%，而交联时间需要预实验来确定。这是因为#交联时间过长，则实验材料易丢失，且交联后的DNA-蛋白质复合体难以用超声打断；交联时间过短，则交联不完全。通常的交联时间为5min-1h，可以随时加入甘氨酸来终止交联反应。

2、超声波断裂染色质

甲醛交联后的染色质对限制酶和 DNaseI高度抵抗，因此通常使用机械剪切力使得染色质断裂。打断后的染色质片段的平均长度应该在500~1000bp左右（可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定）。染色质片段的平均长度对于蛋白质在DNA上结合位点的高分辨率作图非常重要。

3、染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化

用目的蛋白特异性的抗体进行染色质免疫沉淀。抗体的量要进行优化，防止非特异的结合。用Protein-A/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀复合体。经过洗涤除去非特异结合的染色质后，用1%SDS+NAHCO3洗脱免疫沉淀复合体。

4、交联反应的逆转和DNA的纯化

在免疫沉淀复合体中加入不含DNase的RNase和Proteinase K（也可以不加蛋白酶K，交联逆转后用QIAquick DNA cheanup system回收DNA，蛋白还可用于做进一步的分析）65℃保温6h使交联逆转。经酚氯仿抽提-乙醇沉淀纯化DNA。纯化的DNA极少，可用色谱定量。

5、染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定

染色质免疫沉淀的DNA的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用荧光定量PCR分析；如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量研究目的蛋白在基因组上的分布情况，找出反式作用因子的结合位点，可以采用DNA芯片、高通量测序等方法。

ChIP-seq和ChIP-chip都是高通量研究蛋白质DNA相互作用的方法，但ChIP-seq具有许多ChIP-chip技术无法媲美的优势

ChIP-seq最大的优势就是可以精确到单个核苷酸的分辨率。尽管可以通过增加微阵列上排布的探针数目来提高ChIP-chip的分辨率，但是对于大型基因组而言，这就意味着需要增加大量的探针和费用。除此之外，探针杂交过程中的不确定性也限制了 ChP-chip的分辨率。

ChIP-seq减少了ChIP-chjp探针杂交过程中产生的噪音。 核酸杂交过程是一个相对复杂的过程，受诸多因素影响，如靶序列和探针序列的 GC含量、长度、拷贝数、二级结构等，因此，不完全匹配的序列间相互杂交事件经常发生，不可避免地引入大量噪音。 

由于芯片信号识别过程中弱信号常常会被丢弃而强信号会饱和，因此通过ChIP-chip获得的信号强度往往不是线性的，其信号强度的量程限定在一定范围内，而ChIP-seq有效地避免了这种情况。Alekseyenko等在相同的实验条件下比较了ChIP-seq和ChIP-chip数据识别能力，发现ChIP-seq中出现的一些明显的且具有生物学意义的峰（Peaks）常常在ChIP-chip中被掩盖。

ChIP-seq的显著优势就是基因组覆盖范围不受固定在微阵列上探针的限制。 这对分析基因组上的重复区域（如微卫星序列）尤其重要，ChIP-seq可以通过分析重复序列的侧翼序列将这些重复序列精确定位到基因组，而这些信息往往在微阵列方法中被掩盖。在覆盖范围方面，ChIP-seq可以覆盖整个基因组而ChIP-chip通常是选择性地扫描一些特定区域，因此可以在一个更广阔的视野总览基因组全貌。 比如，为了考察某个转录因子在基因组上的结合情况，传统的ChP-chip通常是选取已知基因的GpC岛或转录起始位点（transcriptional start site，TSS）)附近的片段作为考察对象，这种方法通常可以获取大部分的转录因子结合位点。 然而最近人们发现一些转录因子（如 p53、cMYC等）其结合位点在基因组上的分布远非我们之前认为的那样局限而是广泛分布于整个基因组。 对于这类转录因子，ChIP-chip往往是不合适的。

随着测序技术的发展，每一次测序运行(run)容纳的 reads数目越来越多，通过在标本准备阶段对不同的样本进行不同的接头（adaptor）标记处理，可以实现在一次运行中同时检测多个样本，如此大大提高ChIP-seq的性价比。

在测序所需样本数量方面，ChIP-chip需要多达 4~5ug的起始样本，通常在杂交之前需要进行连接介导聚合酶链反应（Ligation-mediated polymerase chain reaction，LM-PCR）)，可能导致背景增高或竞争性扩增导致假阳性。而ChIP-seq仅需要 ng级起始材料，可以只需要很少的扩增循环或完全不需要扩增，并且随着单分子测序平台以及第三代测序技术的出现，测序所需的DNA总量更是大大减少，这对于那些难以大量培养的细胞如神经细胞和干细胞，或难以区分个别细胞与总体细胞行为的实验是很有裨益的。

染色质免疫沉淀是该技术的基础，根据在ChIP过程中是否需要对蛋白质DNA进行交联处理，ChIP可分为X-ChIP和N-ChIP两类，其中X表示“交联”，N表示”自然状态”。X-ChIP主要适用于结合力较弱的DNA-蛋白质相互作用的研究：首先，通过福尔马林处理处于生长状态下的活细胞，使DNA结合蛋白与DNA紧密交联；然后，采用超声仪超声处理染色质，将染色质随机打断为 200~1000 bp的小片段；接着，采用目的蛋白特异性的抗体免疫沉淀蛋白质 DNA复合体，富集目的蛋白靶定的DNA片段;最后，解交联蛋白质 DNA复合体，获取纯净的 DNA片段。

而N-ChIP主要用于组蛋白修饰、核小体定位的研究。 由于组蛋白与 DNA之间的作用力较强，因此在N-ChIP实验中不需要采用福尔马林处理活细胞，而是让 DNA结合蛋白与DNA之间保持一种自然状态，然后，采用一种微球菌核酸酶（MNase）对染色质进行消化。 在染色质免疫沉淀过程中，抗体的质量和对照实验的设计是至关重要的。 选择特异且有效的抗体一方面能够尽可能全面地捕获相关信息，一方面减少了其他噪音的干扰，从而保障了后续实验的进行;而合理的对照试验设计则进一步保证了结果的客观性与真实性。 

通常来说，超声的细胞浓度在1 ×10⁷/mL左右，超声体积视具体仪器而定，对于宁波新芝 TZ-ID型细胞粉碎仪，适合的超声体积为 330-400μL，过大体积将使超声能量无法均匀有效地达到每一处，产生超声不均匀现象，部分片段过大，部分过小;探头深度以距离1.5mL Eppendorf管底部为3-5mm为宜，超声功率起始设在85%，超声参数的设置影响并不是很大。本研究尝试过3s开，6s间歇；1s开，3s间隙；5s开，9.9s间歇，试验结果并无很大差异(数据未展示)。超声过程中由于高能量的作用而使溶液变热，高温可使蛋白变性而影响后续的免疫沉淀反应，间歇时间让处于冰水浴中的管子冷却，只要不引起溶液温度过高，间歇的时间长短并无太大影响 。

（聚生物编辑）