Crispr/Cas9基因编辑

Crispr/Cas9基因编辑
（CRISPR-Cas9 mediated gene-editing）

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技术待认领

技术概述

CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。
RISPR/Cas9技术极大方便了基因编辑的操作。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑，其基本原理为：
第一步先对需要编辑的位点进行切割，造成DNA断裂；
第二步用细胞的DNA修复机制对DNA断裂点进行修复。从而产生需要的突变结果。
目前主要有两种方式进行基因敲除：通过邻端接合反应敲除目的基因或者通过同源重组敲除目的基因。邻端接合反应的优势在于只需要对DNA切割后，细胞自身就能修复。由于不需要重组载体，只需要转入Cas9蛋白和sgRNA就能开始实验，启动非常快速。同源重组法需要在导入Cas9蛋白和sgRNA的同时，转入同源重组的修复。

图1、几种基因编辑方法比较

（资料来源：诺赛基因，英茂盛业）

技术详情

1、邻端接合基因敲除

优点：
1、只需构建一个载体就能开始实验，启动快速。
2、实验设计简单。
缺点：
1、突变随机。后期鉴定工作量大。
2、基因功能缺失对细胞生长有影响时，很难获得敲除成功的细胞。
原理：

工作流程：

（英茂盛业编辑）

2、重组法基因敲除

优点：
1、抗性基因稳定整合到基因组中，阳性率很高。
2、筛选较为容易。
缺点：
1、实验设计较复杂。
2、需要同时构建基因敲除载体和重组修复载体，实验启动慢。
重组法基因敲除原理

重组法基因敲除流程

（英茂盛业编辑）

3、重组法定点突变

定点突变是对指定位置的一个或者数个碱基进行精确编辑。定点突变的目的不是基因功能缺失，而是基因功能的改变。
与重组法基因敲除相比，定点突变要求编辑后基因组上不能残留抗性基因。因此有一定可能未能正确突变的细胞在筛选中存活。定点突变基因编辑的难度要大于基因敲除。
在我们的pCas9gRNA7基因编辑载体中含有lig4和KU70抑制RNA，可以显著抑制非重组DNA修复途径，极大的提高定点突变成功率。

定点突变原理：