ALL SEQ-DNA Protein Interactions(三)

1.ATAC-SEQ

转座酶 – 可及的染色质测序/ ATAC-seq的测定针对血细胞进行了优化

ATAC-Seq使用Tn5转座体检测基因组的无核小体区域 （Buenrostro等，2013）。该方法是常用的，并且优化的方案可用于组织，例如血液（Fast-ATAC） （Corces等人，2016），神经元 （Milani等人，2016），生物样本标本 （Scharer等人，2016）。 ）和单细胞（scATAC-seq （Buenrostro等，2015）和单细胞ATAC-seq （Cusanovich等，2015））。

在该方法中，将gDNA与Tn5转座体一起温育，其在开放的染色质区域中将其片段化并同时添加衔接子。纯化区域的深度测序提供了基因组中无核小体区域的碱基对分辨率。

好处：

两步方案，无适配子连接步骤，凝胶纯化或交联反转

与FAIRE-Seq相比，信噪比高

缺点：

在机械样品处理过程中，结合的染色质区域可能会打开并被转座组标记

只有一半的分子含有PCR扩增所需方向的衔接子

适配子位点之间的距离可能不是PCR扩增的选择 （Sos et al。，2016）

2.CHIA-PET

配对末端标签测序的染色质相互作用分析

ChIA-PET具有免疫沉淀步骤以绘制长程DNA相互作用，类似于Hi-C （Li等人，2010） （Fullwood等人，2009）。在该方法中，DNA-蛋白质复合物被交联和片段化。特异性抗体用于免疫沉淀目的蛋白质。将具有独特条形码的两组接头以分开的等分试样连接到DNA片段的末端，然后基于接近度自连接。沉淀DNA等分试样，用限制酶消化，并测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。Hi-C和ChIA-PET目前在人类基因组中提供较好的分辨率平衡和合理的覆盖率，以绘制远距离相互作用（Dekker等，2013）。

Tang等人（Tang等人，2015）发表了一种改进的方案，称为高级或长读取ChIA-PET 。该方法用2个半接头和单个生物素化的接头连接取代2个单独的连接反应。接下来，将去交联的纯化的DNA片段化，并使用Tn5转座酶在一个步骤中连接衔接子。最后，对DNA进行PCR扩增和测序 （Sati et al。，2016）

好处：

适用于全球检测大量长程和短程染色质相互作用 （Sajan等，2012）

研究特定蛋白质或蛋白质复合物的相互作用

公共ChIA-PET数据集可通过ENCODE项目获得 （Consortium等，2011）

去除传统ChIP分析过程中产生的背景

免疫沉淀步骤降低了数据复杂性

缺点：

需要大量原料，通常至少1亿个细胞 （Mumbach等，2016）

非特异性抗体可以降低不需要的蛋白质复合物并污染池

连接子可以自我连接，产生关于真正DNA相互作用的模糊性

灵敏度有限; 可以检测到少至10％的相互作用

3.3-C

染色质构象捕获测序

3C-Seq （Duan等人，2012），Capture-C和Hi-C （Lieberman-Aiden等人，2009） 包括用于分析染色质相互作用的一系列方法。Capture-C使用磁珠将生物素化片段的额外下拉添加到3C方法中。可以使用Capture-C方法（NG Capture-C）的新改进 （Davies等，2016）。Hi-C方法将3C-Seq扩展到全基因组染色质接触图，并且它也已应用于原位染色质相互作用的研究（Sati等，2016） （Rao等，2014）。

在该方法中，DNA-蛋白质复合物与甲醛交联。将样品片段化，并用限制酶提取，连接和消化DNA。对得到的DNA片段进行PCR扩增和测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。

好处：

允许检测远距离DNA相互作用

高通量方法

缺点：

检测可能是由随机染色体碰撞引起的

不到1％的DNA片段实际上产生了连接产物 （Bourgo等，2016）

由于多个步骤，该方法需要大量的起始材料

4.4C-seq

圆形染色质构象捕获

4C （Zhao等人，2006），（Simonis等人，2006），也称为4C-seq，是类似于3C的方法，有时称为圆形3C。它允许无偏见地检测与特定感兴趣区域相互作用的所有基因组区域（Sajan等，2012）。在该方法中，使用甲醛交联DNA-蛋白质复合物。将样品破碎，连接并消化DNA。得到的DNA片段自我环化，然后进行反向PCR和测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。

好处：

评估各个基因组位点的DNA接触谱的优选策略

高度可重复的数据

缺点：

将错过感兴趣区域的本地交互（<50 kb）

大圆圈不能有效放大

5.5C

染色质构象捕获碳复制

5C （Dostie等人，2007） 允许同时确定多个序列之间的相互作用，并且是3C的高通量版本 （Sajan等人，2012）。在该方法中，使用甲醛交联DNA-蛋白质复合物。将样品片段化并连接DNA并用限制酶消化。使用连接介导的PCR扩增得到的DNA片段并测序。深度测序提供了连接片段的碱基对分辨率。

好处：

与4C不同，5C为许多对站点提供了交互频率矩阵 （de Wit et al。，2012）

可用于重建较大基因组区域的（平均）3D构象

缺点：

需要监管站点的先验信息 （Sati et al。，2016）

检测可能不一定意味着由随机染色体碰撞引起的相互作用

无法扩展到需要大量引物的全基因组研究