miRNA芯片
(miRNA Micoarray)
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技术待认领

技术概述

miRNA在三个方面与信使核糖核酸不同:
(1)miRNAs是相当小的分子,丰度差异较大
(2)成熟miRNAs与其前体pre-miRNA和primiRNA共存,只是长度不同
(3)许多miRNAs序列非常接近,例如同源分子,只是一个或几个核苷酸不同。
所以,常规芯片技术不能直接用于分析这些分子。 一些miRNA芯片产品市面上也可买到,但是这些产品或者繁琐需预分离microRNA,或者缺乏分辨力不能区分同源之间的差异,或者对低丰度的miRNAs不够敏感。
T7-OLA技术产品可分辨同源miRNA,其原理是对每一个miRNA分子,有二条引物(oligo)来识别,每条引物只识别miRNA一半的序列。其中的一个引物中含有标示序列(Tag),另外一个引物含有T7启动子序列。只有序列完全匹配的时候,两种引物才能和miRNA杂交,形成RNA/DNA的杂合体。即使只有一个核苷酸不匹配都会造成杂交或者随后链接的失败。为了增加分子的稳定性,该RNA/DNA的杂合体被延伸了一段序列(加入的另一对寡核苷酸与上述引物在T7和Tag部位互补)。含有生物素(biotin)的段序列通过互补结合到其中一条引物上。通过结合有亲和素的磁珠分离出杂合体。然后两引物在T4连接酶的作用下,被连接成一个DNA片段,随后经过线性扩增(转录),含有生物素的UTP整合到RNA序列中。把转录好的RNA序列和预先准备好的含有不同miRNA序列的膜,进行杂交。最后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素进行反应,加入发光底物测定。

图1. miRNA 芯片分析的流程图

T7-OLA(oligo Ligation Assay)芯片具有以下优点
(1)高识别力-可以区分所有的let7 miRNA isoforms,即便是只有一个核苷酸的差别,也能被检测出来
(2)高灵敏度-可以检测出的微量microRNA
(3)线形扩增-芯片所捕捉的miRNAs会被T7启动子扩增,而不必 像其他产品那样,是通过PCR来扩增,PCR的缺点是可能引入一些干扰因素,从而使得结果分析会出现偏差
(4)无需事先纯化miRNA,总RNA可以直接进行分析
(5)实验过程简单,无需购买PCR,定量PCR仪,以及荧光检测仪等昂贵仪器

(资料来源:生物通)

技术详情

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