染色体步移技术概述
染色体步移技术（Chromosome walking）又称为基因组步移（Genome Walking），指由生物基因组或基因组文库中的已知序列，逐步探知其相邻未知序列或与已知序列成线性关系的目标序列的方法[1]。
染色体步移技术主要分为结合基因组文库的染色体步移技术和基于PCR扩增的染色体步移技术。结合基因组文库的染色体步移技术是先用遗产学分析确定目的基因所在染色体大致位置，然后应用与之连锁的遗传标志作为分子探针，从基因文库中筛出与此标志的5’端和3’端部分重叠的DNA克隆，在已筛得的DNA克隆去筛选与它们邻接的DNA克隆，最后利用生物学性质和测序方法确定寻找的目的基因[2]，适合长距离步移。基于PCR扩增的染色体步移技术步移距离短，适合已知一段核苷酸序列进行的染色体步移，主要有连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR。热不对称PCR反应（Thermal asymmetric interlaced，TAIL-PCR）又叫巢式PCR，是半随机引物PCR中应用最广。
染色体步移技术主要应用于鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点；根据基因的已知片段、EST或插入的转座子序列克隆目的基因，分离基因的启动子及调控元件；用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接；构建图位克隆中的重叠群；转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等。[3]
技术详情
以基因组DNA为模板，根据已知DNA序列，分别设计3条同向且退火温度较高的嵌套特异引物（Special primer，SP），与一个较短且退火温度较低的随机兼并引物（AP）组合，进行3轮TAIL-PCR，进行扩增，获得已知序列的侧翼序列（图1）。
图1 TAIL-PCR原理（图片来源：https://www.takarabiomed.com.cn）
图2 Genome Walking实验流程（图片来源：转导生物实验室有限公司）
DNA提取确保模板无污染；引物设计；巢式PCR反应。
（1）模板DNA不要污染，动物和植物所需基因组DNA为0.1-1 μg，微生物所需基因组10-100 ng。
（2）特异嵌套引物与简并引物的退火温度至少相差10℃；设计3个SP引物，引物长度为22-26 bp，GC含量45-55%，退火温度为60-70℃；引物SP2设计位置在SP1内侧，SP3位于SP2内侧，这3条引物分别是第1到第3轮反应的下游引物，AP为上游引物；根据物种保守氨基酸序列设计兼并引物AP，长度为14 bp，退火温度为40℃。
（3）SP引物保持较低浓度，AP引物浓度高为2.5-5.0 pmol/μL，进行3次TAIL-PCR反应使用的AP引物为同种AP引物。
（4）第1轮PCR结束，将PCR产物稀释一定倍数（1-1000）后取1 μL作为第2轮扩增的模板，第2轮的PCR产物稀释一定倍数（1-1000）后取1 μL作为第3轮的模板；第2轮扩增和第3轮扩增的PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，第3轮扩增条带大小比第2轮扩增小。
（5）第3轮扩增的PCR产物切胶回收纯化，以SP3为引物进行测序。
Q1：第一轮PCR扩增常常出现较多非特异扩增？
A1：是通用引物AP引起的单引物非特异扩增，PCR反应采用梯度退火程序；延伸时间长更容易产生非特异扩增，应适当缩短延长时间；后面通过第2轮和第3 轮PCR扩增提高产物的特异性。
Q2：高等植物步移过程中出现高级结构AT含量高，无法进行步移？
A2：更换SP引物位置；更换好的Genome Walking试剂盒进行步移扩增。
Q3：获取的侧翼序列测序有套峰？
A3：可能是非特异性扩增或PCR产物不纯，DNA结构本身复杂，需要重新设计测序引物或者克隆测序。
Q4：Genome Walking试剂盒中所有的AP引物都没有扩增出新清晰条带？
A4：若第2轮和第3轮PCR无清晰条带，应扩大模板的稀释倍数；可能基因组模板中有抑制PCR反应物质，减少基因组模板的使用量或重新提取纯化基因组DNA；重新设计SP引物。
优点：操作简单、快速高效、特异性高、反应产物准确可靠、重复性好等。
缺点：反应条件精细，进行3轮连续嵌套反应，任何一轮都会影响结果；需要较多的引物组合；反应不是每次都有阳性结果，第一轮扩增常常为非特异性扩增。
PCR产物或TA克隆测序结果；扩增胶图或菌落PCR胶图。
相关试剂：DNA提取相关试剂；PCR产物胶回收试剂；Genome Walking提取试剂盒等。
相关仪器：PCR仪，紫外照胶仪，离心机，超净工作台等。
1. 赵寿元. 英汉遗传工程词典(第二版). 上海: 复旦大学出版社,1999, 48.
2. 方福德. 医学分子生物学词典[M]. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1995,67.
3. 梁成真等. 染色体步移技术研究进展[J]. 生物技术通报, 2009, 10: 75-82.
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