细胞增殖测定和细胞活性测定

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作者：劳拉·科布

（美国加州大学洛杉矶分校(至2012年1月)；LCS执行咨询，洛杉矶，美国）

DOI：//dx.doi.org/10.13070/mm.en.9.2799

最后修改日期：2019-10-23；原始版本：2019-07-28

引用方式：MATER METHODS 2019;9:2799

摘要：对细胞增殖和生存能力的检测方法进行了全面的综述，并对Labome的正式出版物进行了调查。

 

细胞增殖检测

目前有许多方法和试剂盒可用来测量细胞增殖、线粒体功能和间接的细胞活力等许多方面。然而，在已发表的文献中，对这些数据的过度分析和错误解释变得越来越频繁。在细胞增殖试验中，得出的结果应该能直接而准确地测量一个群体中活跃分裂细胞的数量，无论是培养细胞还是组织细胞。相比之下，细胞活力测定法被设计用来提供一个群体中“健康”细胞数量的指标，通常通过评估代谢活性细胞的具体指标，这些细胞通常与线粒体功能相关。与增殖试验不同，这些测量不能区分静止/衰老细胞和分裂中的细胞。-半乳糖苷酶活性测定或染色法可显示衰老细胞[1]。

ACEA Biosciences公司的xCELLigence RTCA DP实时细胞分析仪等无标签方法可以测量细胞数量的增加，从而量化细胞粘附、增殖、脱落/死亡[2]。

图1.BrdU掺入量测量法

DNA合成评估

检测细胞增殖的传统方法是通过评估标记的DNA类似物或前体（5-溴-2'-脱氧尿苷（BRDU），一种取代胸腺嘧啶的嘧啶类似物，与新的DNA结合来测定DNA合成，或[3h]-胸腺嘧啶核苷）进入细胞周期s期的基因组DNA。例如，Maun HR等人用3h-胸腺嘧啶核苷掺入法评估了支气管平滑肌细胞的增殖[3]。对于培养中的细胞，最常用的方法是通过比色ELISA评估BrdU掺入（图1）。类似的方法也可用于评估体内增殖细胞，在采集前用BrdU脉冲标记组织，然后用ELISA或免疫组化染色评估BrdU。这也可以通过流式细胞术进行评估；图2显示了BrdU与7-AAD的对比。

一种较新的方法是将含有炔烃的胸腺嘧啶类似物EDU（5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷）并入DNA中，并通过激发反应（铜催化叠氮化物-炔烃环加成）检测所加入的EDU。对于Exmaple，Ouadah Y等人每天向小鼠注射I.P.，BRDU和EDU，并通过抗BRDU抗体（ABCAM AB6326）检测标记细胞，然后在冰冻切片上点击Thermo Fisher的EDU试剂盒，以研究肺神经内分泌细胞的激活情况[5]。

图2.BrdU与7-AAD的流式细胞检测示例。©Becton, Dickinson and Company

BrdU本身可能影响细胞生理学。它可以促进转录因子和化学诱导的重编程[6]，也可能改变DNA结构[7]。

表1 在已验证抗体数据库中的60000多份正式出版物中，增殖标记物和针对它们的最高引用抗体。列出了每个供应商最常引用的单克隆抗体。

标志物 蛋白名称 前三供应商
MKI67 增殖标志物Ki-67 Invitrogen MA5-14520 (755), Dako M7240 (253), Abcam ab16667 (153)
PCNA 增殖细胞核抗原 Invitrogen MA5-11358 (180), Santa Cruz Biotechnology sc-56 (178), Abcam ab29 (66)

增殖标记物染色

在固定动物组织和细胞群的切片中，增殖通常通过免疫染色来评估特定的增殖标记物，其中一些标记物在这里描述。Ki-67是一种与细胞增殖和核糖体RNA转录相关的核蛋白[8]。传统的Ki-67抗体只能用于冰冻切片染色，不能用于石蜡包埋切片染色。然而，针对Ki-67不同表位的新型mib-1抗体也可用于福尔马林和石蜡固定切片染色，增加ki67作为增殖标志物的应用。Ouadah Y等用Ki-67抗体（Thermo Fisher 41-5698-82和50-5698-82）染色小鼠肺冰冻切片，研究损伤诱导神经内分泌细胞增殖[5]。Nam S等人使用Ki-67染色和流式细胞术来估计细胞周期的G0和G1期三维水凝胶培养的细胞比例[9]。

增殖试验的注意事项

所有直接或间接测量dna合成的分析都对细胞周期的阶段具有内在的敏感性。因此，根据检测结果，可能有必要通过血清停药使细胞聚集在G1期（也可能影响生存能力）或化学抑制DNA合成，阻断S期细胞与胸腺嘧啶、阿糖胞苷、羟基脲或氨基蝶呤同步。

细胞生存能力分析

以细胞为基础的测定生存能力的方法主要可分为三类:利用细胞膜完整性丧失的方法、直接测定代谢标志物的方法和测定代谢活动的方法。还有其他形式的检测。如结晶紫染色可以检测细胞的粘附情况，从而检测粘附细胞[10]的生存能力。例如，Lee YR等人使用结晶紫染色来评估PTEN K342/K344R突变体对PC3细胞增殖的影响[11]。

代谢物分析

现在有许多不同的代谢检测方法，下面将讨论其中的许多方法。这些检测要么包括测量重要代谢蛋白（如ATP）的水平，要么利用细胞内四氮唑盐或resazurin染料的还原作用。细胞增殖过程中NADPH/NADP, FADH/FAD, FMNH/FMN,NADH/NAD比值均升高。在这些代谢中间产物细胞脱氢酶或还原酶的存在下，四氮唑盐被还原为甲酰胺产品，其可通过由此产生的比色变化来检测。类似地，Realururin（7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮10氧化物）是一种非荧光蓝色氧化还原染料，还原为ReavuFin，一种红色荧光化合物，同时给出荧光和比色变化。常用基底物及其一些优缺点如下：

  • MTT：MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-四唑溴化物）是一种四唑盐，通过线粒体和线粒体外脱氢酶还原，形成不溶性蓝色蓝甲瓒晶体，这意味着在读取分析之前需要一个增溶步骤[12]。此外，在该分析过程中，细胞不能存活，这意味着重复或补充分析时不能在同一个细胞板上进行。
  • MTS/XTT：MTS（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑）和XTT（2,3-双-（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四氮唑-5-羧苯胺）基质类似于MTT。然而，一个优点是这些反应是在中间电子受体吩嗪甲磺酸（pms）的存在的情况下在细胞内进行的，这提高了它们的灵敏度。此外，还原后的甲酰胺产品可溶并释放到培养基中，消除了MTT所需的额外溶解度步骤。然而，据报道，细胞培养基中的酚红、脂肪酸和血清白蛋白都会扭曲长期培养期间从MTS、XTT和WST分析获得的数据[13]。Promega实时GLo-mt细胞活力测定探索细胞内还原环境，将一种化学物质还原成适合于纳米荧光素酶的底物。
  • Alamar Blue：Alamar Blue是一种Resazurin化合物，在活细胞中还原为Resorufin和二氢Resorufin。它能进入活细胞，所以不需要细胞裂解，在培养基中稳定。该方法的另一个优点是可以在荧光和比色读板器中进行测量。Silva Mc等人使用Thermo Fisher Alamar Blue试剂，在Tau蛋白降解剂QC-01–175处理后，测量诱导的多能干细胞衍生神经祖细胞的细胞活力[14]。Domny SS等人使用Thermo-Fisher-Alamar Blue试剂测定了用牙龈卟啉单胞菌（含或不含牙龈抑制物或抗生素）攻击人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的存活率[15]。
  • WST：水溶性四氮唑盐（WSTs）是一种细胞不透性的四氮唑染料，通过质膜电子输运在细胞外还原[16]，并与电子受体PMS结合生成水溶性的甲瓒染料(formazan)。Noda s等人用Dojindo实验室的细胞计数试剂盒8（含有WST-8溶液）检测了原代牙髓干细胞的活性[17]。

有很多可用的检测方法可以测量作为细胞整体健康输出的ATP水平。当细胞开始发生凋亡或失去膜完整性时，ATP储备由于ATP酶的被抑制活性耗尽，同时阻止任何新的ATP合成。这会导致细胞内ATP水平迅速下降。发光ATP分析（如promega的细胞滴度GLO）通过溶解细胞释放ATP储存，同时抑制ATP酶的功能。Luciferase在荧光素和ATP的存在下催化荧光素氧化为氧基荧光素，产生与细胞内ATP浓度直接相关的发光信号〔18, 19〕。

使用代谢物测定时的限制和注意事项

当选择合适的代谢物分析方法来满足您的需求时，有许多需要做出的决定。上面列出的每一种基质，以及本文中没有涉及的相关基质，在直接比较时都有各自的优和缺点。分析灵敏度、噪声信号比、易用性和试剂稳定性都是需要考虑的因素。代谢物测定法的另一个需要考虑的是，这些底物的减少受到细胞内代谢活动变化的影响，而这些变化对细胞的整体生存能力没有直接影响；因此，你试图回答的问题将在你选择合适的检测方法中起到关键作用。

膜完整性测量法

这类测量方法中，所有的生存能力测定都依赖于细胞失活时细胞膜的破裂，这就造成要么允许大分子进入细胞，要么允许细胞内的蛋白质分泌到培养基中。

  • LDH(乳酸脱氢酶)：乳酸脱氢酶是一种普遍存在的、稳定的细胞质酶，能将乳酸转化为丙酮酸。如果细胞膜受损，LDH，其酶活性从细胞中释放出来，可以在细胞培养基中检测到。在乳酸转化为丙酮酸的过程中，NAD+还原为NAD H/H+。基于乳酸脱氢酶的活力分析利用自由氢离子的形成，通过催化H+从NADH/H+转移到四唑盐INT（2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑氯化物），将其还原为红色的甲醛染料[20]，或者在Promega细胞毒素一项检测中，将Resazurin转化为荧光形式Resofrufin[21]。PelsEK EK等人使用皮尔斯LDH细胞毒性检测试剂盒来测量Charcot Leyden晶体引起的坏死细胞死亡[22]。
  • Trypan Blue（台盼蓝）：用台盼蓝对细胞悬浮液进行染色是最古老和最简单的活力测定方法之一。在健康、有活力的细胞中，完整的细胞膜将阻止台盼蓝进入细胞。在死亡或正在死亡的细胞中，台盼蓝会进入细胞，染成蓝色。这种方法传统上是用显微镜和血细胞仪手工定量的，这使得它耗费人力。然而，最近可负担得起的自动细胞计数器的可用性，例如，来自Beckman Coulter[23]的VI Cell™自动细胞活力分析仪和计数器，使得该分析比以前更省时、更准确。其他类似荧光染料也可以使用。例如，Aizarani N等人通过BioLegend的Zombie Green筛选活细胞[24]。
  • Calcein-AM（钙黄绿素AM）：Calcein acetoxymethylester是一种非荧光染料，用于细胞活力和细胞凋亡试验，例如，用于检测Abeta肽及其低聚物的细胞毒性〔25〕。它是亲脂性的，可以很容易地通过细胞膜。一旦进入细胞内，细胞内的酯酶就会分解乙酰甲氧基的酯键，从而形成一种荧光性的阴离子和亲水性钙黄绿素染料，这种染料被困在细胞内。失活细胞不含活性酯酶，因此可以用这种方法来衡量细胞的存活率。Cu2+、Co2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+在生理pH下使钙黄绿素的荧光信号猝灭，这意味着必须注意选择合适的细胞培养基。
  • Propidium Iodide/7-AAD（碘化丙啶，Pi/7-AAD）:这些插层剂常用于上述细胞周期的研究。然而，由于它们是膜不渗透的，它们被排除在活细胞之外。这意味着PI在非活细胞中发出的荧光信号可以通过荧光显微镜或流式细胞仪分析来测量。例如，Nortley R等人用7.5 uM碘化丙啶评价周细胞死亡[26]。
  • 细胞不可渗透的DNA结合染料，如Thermo Fisher的Sytox。这些染料通过受损的细胞膜进入细胞，与DNA结合后显示出强烈的荧光。例如，Samir P等人在来自Essen Biosciences的双色孵化器放大成像系统下使用Sytox Green染色实时监测培养的骨髓源性巨噬细胞中的细胞死亡[27]。

来自Labome对正式出版物的调查结果

本部分由Labome提供，帮助指导研究人员确定最适合的细胞增殖和细胞活力检测试剂盒。Labome调查正式出版物。表2列出了用于细胞分析的试剂/试剂盒的主要供应商。这里列举了一些应用程序。Zeng Q等人使用Roche公司的MTT细胞增殖试剂盒测量乳腺癌细胞生长[28]。Nam S等人用Thermo Fisher Scientific的EDU测量了3D水凝胶中的细胞增殖[9]。Ombrato L等人使用流式细胞仪中Thermo Fisher的Click It+EDU流式细胞仪分析试剂盒，评估了MMTV–Pymt肌动蛋白–GFP细胞在与Macs分类的EPCAM+和Ly6G+小鼠细胞二维共培养中的体外增殖[29]。Genet G等人使用Acea Biosciences的Xcelligence RTCA-DP分析仪测量了血管内皮细胞对血管内皮生长因子A的反应[2]。Herb M等人使用Thermo Fisher Scientifico的cyquant直接细胞增殖试验评估了巨噬细胞在培养中的生存能力[30]。

表3.主要细胞增殖和活性检测试剂/试剂盒，基于正式出版物的Labome调查。

supplier kit methods sample references
ACEA Biosciences xCELLigence RTCA DP analyzer label-free [2]
BioLegend Zombie Aqua flow cytometry, immunocytochemistry [31]
BioLegend Zombie Green FACS [24]
Dojindo Laboratories Cell Counting Kit-8 Green colorimetry [17]
MilliporeSigma BrdU immunohistochemistry [5]
MilliporeSigma MTT [28, 32]
Promega CellTiter 96 AQueous [33, 34]
Promega CellTiter-Glo luminescent assay [23, 35]
Promega CellTiter-Glo 3D luminescent assay [36]
Promega CytoTox 96 [37, 38]
Promega CytoTox-ONE [21]
Promega RealTime-Glo MT [39]
Roche WST-1 [40]
Thermo Fisher Alamar Blue imaging [14, 15]
Thermo Fisher Click-iT Edu immunochemistry, flow cytometry [2, 5, 9, 29]
Thermo Fisher CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay cell imaging [30]
Thermo Fisher LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit flow cytometry [41]
Thermo Fisher SYTOX cell imaging [27, 36]

致谢

这篇文章来源于Laura Cobb博士2013年2月发表的一篇文章“细胞检测:细胞周期、细胞增殖和细胞死亡（Cell-Based Assays: the Cell Cycle, Cell Proliferation and Cell Death）”。

参考文献

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ISSN : 2329-5139

细胞增殖(2)细胞活性(1)
聚生物
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