微生物宏组学通关技能

原创： Frasergen 菲沙基因

微生物是地球上最古老的生命形式之一，它们体形微小，有些不为我们肉眼所发现，结构简单，却无处不在，尽管很多时候不被我们所注意，但却非常重要，是整个自然生态链中不可或缺的一部分。高通量测序技术的快速发展及成本的降低，使得微生物研究更加深入和广泛，研究成果不断涌现于各大期刊杂志，包含Science、Nature、Cell等国际顶尖学术期刊。

如何选择不同的微生物宏组学解决方案？

基于高通量测序研究微生物宏组学的解决方案：扩增子测序、宏基因组测序、宏转录组测序，那么如何根据研究目的选择不同的宏组学解决方案呢？

✦如果我们想知道环境中存在哪些微生物？每种微生物的丰度情况如何？

答：扩增子测序（16S/18S/ITS可变区扩增子、全长16S/18S/ITS）

✦如果我们不仅想知道环境中存在哪些微生物，还想知道微生物有哪些功能？

答：二代宏基因组测序、三代宏基因组测序

✦如果我们进一步想知道这些环境微生物正在行使什么功能？

答：宏转录组测序

扩增子测序

扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获片段进行测序，16S、18S、ITS rDNA 被认为是最适于细菌、真核微生物、真菌系统分类鉴定的指标。

 

宏基因组 (Metagenome)

以环境中全部细菌、真菌、古菌等的基因组遗传物质DNA为研究对象，进行de novo组装，以基因为研究单元，进行物种多样性、基因结构、差异基因和功能基因等的研究。

环境微生物应用领域

宏组学测序适用于各种自然环境及人或动物微生态的研究，下面让我们来看看它的运用领域：

常见样本类型

宏组学的应用非常广泛，涉及各种各样的环境类型，土壤、水体、污泥、食品发酵液、小鼠肠道、反刍动物瘤胃等；人肠道微生物的研究中，宏组学的运用也非常的广泛，涉及各种各样的样本类型，胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、粪便等。

参考文献

1.    Ni J, Shen T C D, Chen E Z, et al. A role for bacterial urease in gut dysbiosis and Crohn’s disease[J]. Science Translational Medicine, 2017, 9(416): eaah6888.

2.    Wilck N, Matus M G, Kearney S M, et al. Salt-responsive gut commensal modulates T H 17 axis and disease[J]. Nature, 2017, 551(7682): 585.

3.    Thompson L R, Sanders J G, McDonald D, et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity[J]. Nature, 2017.

 

16S与宏基因组的区别

 

16S rDNA测序及宏基因组测序都是研究微生物的重要方法，那么这两者到底有什么区别呢？什么情况下选择16S测序？什么情况下选择做宏基因组测序？

测序原理不同

16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rDNA的DNA序列，具有高度的保守性。该序列具有10个保守区域和9个可变区域（V1-V9），其中保守区域在细菌间差异不大，高可变区具有属或种的特异性。

16S rDNA的结构

对16S rDNA某个高可变区进行测序，用于研究环境微生物中细菌或古菌的群落结构多样性。通过对某一段高变区序列（V4区或V3-V4区）进行PCR扩增后进行测序，得到1500bp左右的序列。

16S的测序原理

宏基因组测序则是将微生物基因组DNA随机打断成350bp的小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，再通过组装的方式，将小片段拼接成较长的序列。

宏基因组测序原理

 

研究内容不同

16S测序主要研究群落的物种组成、物种间的进化关系以及群落的多样性；宏基因组测序在16S测序分析的基础上还可以进行基因和功能层面的深入研究：

	16S	宏基因组
物种组成	√	√
物种丰度	√	√
基因预测	X	√
功能注释	X	√
代谢通路	X	√
功能分析	X	√

 

鉴定到的物种及深度不同

✦ 在界水平上，宏基因组有细菌、古菌、真菌和病毒的信息，而16S只有细菌和古菌的信息。

✦ 在种水平上，宏基因组测得的物种种类高于16S，是因为16S这一测序技术的限制，鉴定到种水平的很少。

✦ 在门、纲、目、科、属水平上，宏基因组测得的物种种类没有16S多，因为16S选的是某一可变区，可测到低丰度的物种的种类远远多于宏基因组，因此16S测得的物种种类在门、纲、目、科、属分类水平上更丰富。

✦ 对于16S测序而言，任何一个高变区或几个高变区，尽管具有很高的特异性，但是某些物种（尤其是分类水平较低的种水平）在这些高变区可能非常相近，能够区分它们的特异性片段可能不在扩增区域内。

✦ 宏基因组测序通过对微生物基因组随机打断，并通过组装将小片段拼接成较长的序列。因此，在物种鉴定过程中，宏基因组测序具有较高的优势。

 

研究重点不同

16S研究侧重于解答群落结构，而宏基因组测序则侧重于解答菌落的功能。

一句话总结：宏基因组测序研究是16S测序分析的升华与补充。

研究微生物群落结构的组成差异及特征，选择16S测序；研究微生物的群落结构、物种分类、基因功能及代谢网络，选择宏基因组测序；当然我们还可以采用16S与宏基因组测序联合的研究思路，即大样本量进行16S测序，根据差异物种，选部分代表样品进行宏基因组测序。

全长16S rDNA测序

 

16S rDNA长度大约为1500bp左右，三代平台的PacBio Sequel的平均读长为8-12Kb，因此结合该平台可以成功测序获得16S/18S的全长序列，全长序列信息不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而能更加真实的还原样本中微生物的群落结构。

全长16S产品优势

高通量--能同时分析群落中所有的微生物

高数据质量--采用PacBio的CCS模式，对序列自我矫正，数据一致性准确率高

高分辨率--分析16SrDNA全长，分类精准到种。

	二代扩增子	三代全长扩增子
样本要求	无严格样品要求，只要能扩出相应片段
扩增区域	1-2个高变区，如16S的V4/V5	全长序列
测序平台	Illumina MiSeq/HiSeq	PacBio Sequel
测序数据量	≥30,000 Tags	≥ 5,000 CCS
分析内容	微生物群落组成与丰度
结果准确性	一般	准确度高
成本	低	较高

 

经典案例分析^[1]

样品来源：模拟菌群（已知单菌混合）和湖水样本

测序策略：PacBio RSII（FL-16S，PhyloTags）

Illumina MiSeq（16S-V4区，V4 iTags）

分析思路：

①模拟菌群验证PhyloTags准确性；

②湖水菌群样本PhyloTags和V4 iTags比较

③ PhyloTags提高菌群分辨率的原因解析

（1）模拟群落验证SMRT测序

研究人员使用含有23个细菌参考基因组的模拟群落得到一系列PacBio 16s rRNA基因序列数据，并将SMRT技术产生的全长 16s rRNA基因序列称为PhyloTags。5个模拟群落的高质量PhyloTags数据成功分成22个OTU，每个OTU的16s rRNA基因相似度高于97%。通过质量分选出来的质量最好的PhyloTag对模拟基因组16s rRNA基因的相似度是99.5%。另外，5个PhyloTag技术重复的相关性非常好，相互之间的相关系数均达到96%以上，并且与鸟枪法打断的meta序列具有很强相关性。在模拟群落实验中，PhyloTags的结果可以与传统iTag测序结果相媲美。

 

（2）Sakinaw湖水菌群分析

Sakinaw湖含有丰富的微生物类群，研究人员选取8个不同深度的湖水进行采样，分别对这些样本进行PhyloTag和V4 iTag分析。结果表明，V4 iTags数据中有0.2-4.1%的微生物在门水平上无法区分，而PhyloTags则能在门水平上将这些微生物完全区分。比较各个深度的PhyloTag和V4 iTag数据，发现深度在50-120m时，两者在门水平上的微生物分类差异明显。在环境样本中，短读长测序数据在复杂群类区分中失去优势，而PhyloTags则能在属水平上对菌群进行区分。

（3）PhyloTags提高菌群进化分类的分辨率

为了评估扩增子长度对群体分析的影响，研究人员随机抽取了Sakinaw样本中的1818条PacBio FL序列和它们对应的二代测序产生的V4区域序列进行成组比较。结果表明，在多个实例中相同的序列对表现出来不同的鉴定结果，产生这些结果的原因是16s rRNA基因的突变位点分布并不均匀，高估或低估这些突变都将影响微生物群落的分类。

综上所述，PacBio全长16S rDNA测序可提供更准确的物种分类和更多的物种鉴定，在系统发育、群落鉴定和代谢通路预测方面都更有优势。

 

参考文献：

1.Singer E, Bushnell B,Coleman-Derr D, et al. High-resolution phylogenetic microbial community profiling[J]. The ISME journal(2016).

 

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