“雨露均沾”-— RNA甲基化“搭讪”成熟miRNA又出新花样

来源：云序生物     日期：2019年10月25日

提起miRNA你是否嫌弃它是过气网红，结合UTR区调控靶基因表达量的段子是不是还在循环播放？被circRNA/lncRNA吸附建立ceRNA机制的故事你是否已经不愿复盘？没关系，云序生物教你m6A“搭讪”成熟miRNA秀出更好的你！
m6A可以影响miRNA与靶基因的结合从而影响ceRNA机制建立，要么m6A发生在pri-miRNA影响miRNA的加工成熟导致成熟miRNA表达改变，甚至miRNA直接作用于重要的m6A相关酶起到调控作用。但现在小编要讲的故事才正式宣布成熟miRNA和RNA甲基化牵手成功！一项来自日本研究团队有关miRNA m6A修饰的研究结果中证明部分成熟的miRNA也会被m6A/m5C甲基化修饰，并且这部分被修饰的成熟miRNA在癌症组织当中有明显差异表达。这一研究成果让我们对这一“昨日明星”又有了新的认识！分子量不管是成千上万，还是只有22nt，甲基化修饰都会“雨露均沾”！

原文链接：Distinct methylation levels of mature microRNAs in gastrointestinal cancers.

发表日期：2019年8月29日
运用技术：m6A MeRIP-seq
近期有多篇文章表明有大量的编码以及非编码RNA可以被化学修饰，这种修饰对于胚胎发育以及生物分子的理化性质有重要的影响。成熟的tRNA长度为70-90nt，长度类似于miRNA前体分子，而成熟tRNA分子上大量的化学修饰来维持tRNA生物功能这一现象让研究者猜想成熟的miRNA一定也有许多化学修饰。本项研究中，作者呈现了运用MeRIP以及其他方法证明成熟miRNA上同样有不止一种甲基化修饰。

1. 癌症样本中甲基化修饰miRNA检测
   作者在消化道癌细胞中分析RNA甲基化（m6A/m5C）相关的酶的改变，GEO数据分析结论显示，相比于正常组织，在胰腺癌当中METTL3和METTL14呈高表达趋势，METTL3和ALKBH5呈负相关，提示RNA甲基化水平在消化系统肿瘤当中有上调的趋势。通过LC-MS的方法对不同长度小RNA的检测发现，常见的m5C、m6A修饰以及m1A占比A、C碱基1%~8%。在使用表皮生长因子刺激细胞之后发现，甲基化修饰的miRNA比例有所上升，这暗示RNA修饰是受系统性的调节的。

图1：癌症当中重要酶的变化

2. 甲基化miRNA对靶基因的抑制效果发生改变
   体外合成的带有和不带有m6A或m5C修饰的miR-200c转入DICER基因5号外显子缺陷的癌症细胞细当中发现，相比于m5C修饰或不甲基化的状态，m6A修饰的miR-200c-3p不会减少靶基因mRNA的表达水平。
3. 检测甲基化修饰miRNA
   基于之前的实验结果，研究者推断在消化道癌症当中甲基化修饰的miRNA很有可能作为癌症的生物标志物，m6A-IP-seq（即m6A MeRIP-seq）方法检测发现63个在4种不同消化道癌症细胞系当中均发生甲基化修饰的miRNA，当然本次研究当中作者研发了MALDI-TOF-MS，一种基于质谱的技术对这些被修饰miRNA进一步单碱基分辨检测，两种方法共同评价在胰腺癌组织当中的miRNA甲基化水平。在这些被检测到的miRNA当中，研究者发现了熟悉的身影，比如之前被研究的成熟体let-7a-5p和miR-17-5都具有m6A修饰，并且成熟体miR-21-3p和miR-200c-3p带有m5C修饰，在胰腺癌和结直肠癌当中均验证了这些miRNA具有甲基化修饰，但是这种甲基化并没有影响miRNA本身的表达量，与此同时病人血清当中这些miRNA的甲基化水平相比于正常人也同样处于较高的水平。

图2：4种不同细胞系的甲基化miRNA检测

4. 预测miRNA甲基化影响RISC复合物的结构功能
   成熟miRNA到底有什么样的生物学功能？分子模拟AGO蛋白和miR-17-5p、200c-3p、let-7a-5p分别在甲基化与未甲基化的结合情况，模拟结合结果显示在甲基化化学基团附近AOG蛋白和RNA之间的结合情况有所不同，周围空间缩小并且蛋白范德华力被增强，第9位的C碱基的m5C修饰破坏了AGO蛋白220号Ser氨基酸的氢键，从而引起了AGO蛋白Arg761结合的第8个G碱基的位移，相反m6A修饰引起复合物整体结构的巨大变化（尤其是miRNA的识别区域）从而改变miRNA对靶基因的相互结合，整体来看m6A修饰降低了miRNA对靶基因mRNA翻译的抑制作用。

图3：修饰位点

5. 甲基化miRNA是消化道癌症的重要生物标志物
   健康与胰腺癌病人血浆当中miRNA甲基化检测结果显示，miRNA-17-5p在胰腺癌病人样本当中都呈现高甲基化趋势，在对照中是无甲基化或者低甲基化。甲基化miRNA做胰腺癌早期诊断标志物的效果要明显优于传统标志物CA19-9和CEA，所以评价miRNA甲基化在临床上将有极大的应用价值，大样本的甲基化miRNA筛查很有可能用于临床诊断。IP类和MS类的检测手段在检测甲基化miRNA方面将得到应用。

图4：癌症甲基化miRNA临床相关性明显

在小编看来，以m6A为代表的甲基化修饰真是“雨露均沾”，不管编码蛋白的mRNA还是非编码的lincRNA、circRNA、miRNA、rRNA、tRNA分子，他们都有甲基化修饰。于此同时，甲基化又可以影响RNA分子的“一生”，从RNA分子的转录可变剪切、结构的改变到被RNA转运出核加工成熟到降解或翻译蛋白，甲基化修饰与RNA分子一生相伴。

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