Prime editing纠正点突变，有望治愈遗传病
来源： 生命奥秘|2019-11-26|编译：张洁
碱基编辑工具可以有效地纠正细胞、动物模型中的点突变。或许在未来该技术能应用于临床，纠正病人的点突变。
当黄兴旭开始考虑纠正人类基因组中的致病突变时，他的注意力自然而然地转向了CRISPR-Cas9。但他迅速发现，这种流行的基因编辑工具对大多数人类疾病的致病突变来说并不理想，因为大部分致病突变是由单DNA核苷酸的错误（称为点突变）引起的。在人类基因组中，已知有超过31000个这样的突变与人类遗传疾病有关。但CRISPR在纠正这些错误方面并不是特别有效。随后，黄兴旭了解到碱基编辑器——一类新的基因组修饰蛋白，在纠正点突变上非常有效。
碱基编辑器通过化学方式将一个DNA碱基改变为另一个碱基，而不完全断裂DNA链。第一个胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）是在2016年由马萨诸塞州剑桥市哈佛大学（Harvard University）的化学生物学家David Liu和Alexis Komor联合开发的，它可以将胞嘧啶-鸟嘌呤（C-G）碱基对在靶向基因组位置上化学转化为胸腺嘧啶-腺嘌呤（T-A）碱基对。一年后，Liu实验室的另一位研究员Nicole Gaudelli研制出了第一个腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, ABE）：它以化学方式把A-T转化成G-C碱基对。
中国上海科技大学的遗传学家黄兴旭指出，碱基编辑的效率非常高，在细胞系中大约有40-50%的有效率。与传统的基因组编辑技术相比，这是非常高效的，毕竟基因组编辑的有效率仅为十分之一。同时，碱基编辑器不仅比CRISPR-Cas9更有效，它们发生错误的概率也更低。CRISPR-Cas9起着分子剪刀的作用，会剪切两条DNA链。当细胞修复断裂时，可能会插入或删除随机碱基，从而改变基因序列，引起新的突变。大的染色体片段甚至可能被删除或重新排列。碱基编辑器只改变一个特定的核苷酸而不产生双链断裂，因此可以减少不必要的错误。
研究人员将这些工具应用到进化树上，在从细菌和酵母到大米、小麦、斑马鱼、老鼠、兔子和猴子等一系列模型上测试该工具的有效性。他们用这些单碱基编辑工具来敲除基因，创造和修正动物模型中的基因突变。并且，他们已经在实验室里将其应用于非常早期的人类胚胎。未来，他们可能会使用碱基编辑器来治疗人类遗传疾病。
然而，首先，研究人员必须克服一些关键障碍。与CRISPR-Cas9一样，碱基编辑器有时也编辑目标位点之外的位点，即脱靶效应。并且，其可以编辑的基因组区域和可以执行的碱基转换非常受限。此外，如果要将它们用于临床，研究人员必须更好地将它们输送到组织中。
但是，改良版的编辑器正在迅速发展。Liu表示，这确实证明了研究人员在这一领域取得进展的速度有多快，我们现在有几十个碱基编辑器，它们提供了更大的靶向范围，改善了DNA的特异性，并减少了脱靶效应。Liu构建的碱基编辑工具已经被分发到世界各地的1000多个实验室，几乎每周都会有使用这些和相关工具的新论文发表。
构建一个编辑工具
为了创建第一个碱基编辑器，Komor利用了一种叫做APOBEC1的天然酶。这种酶是胞苷脱氨酶家族的一个成员，通过化学反应将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），尿嘧啶是RNA中T的类似物。Komor将大鼠APOBEC1与催化受损的Cas9核酸酶融合，使其不能产生DNA双链断裂。当向导RNA引导APOBEC1-Cas9融合蛋白到达目标位点时，脱氨酶将C转化为U。细胞的DNA修复系统将其转化为U-A碱基对，并最终将其转化为T-A对，从而修复U-G的错配。
进一步的改进提高了该系统的效率，这些改进包括用Cas9的“切割酶”（nickase），它可以切断含有G的链，从而在修复U-G不匹配时，促使细胞替换G而不是U。现在任职于加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的Komor指出，这些改良将基因编辑效率提高到了让我们满意的水平。这种蛋白质被命名为BE3，它编辑细胞DNA的效率几乎是CRISPR-Cas9的十倍，插入或删除随机碱基的概率不到1%。
第一个腺嘌呤碱基编辑器的构建面临重重困境。没有一种已知的天然酶能把DNA中的腺嘌呤（A）转化成鸟嘌呤（G）。Gaudelli表示，创造一种不存在的酶并让它很好地工作是很难的。幸运的是，Liu的实验室擅长利用微生物实现蛋白质的快速定向进化。经过七轮的进化和蛋白质工程，Gaudelli逐渐诱导出一种叫做TadA的细菌酶，它能在一些RNA中把A转化成G，从而实现DNA编辑，并在哺乳动物细胞中更加有效。这个腺嘌呤编辑系统名为ABE7.10。
尽管这些酶只能影响可能的核苷酸变化的一个子集，但至少在理论上，它们已经可以解决人类大多数致病点突变。Liu指出，特别是腺嘌呤碱基编辑器，纠正了人类最常见的点突变。他指的是G-C被替换成A-T的突变，这一突变占了所有已知致病单核苷酸变化的一半。目前这项技术仅供实验室使用。
纠正和创造突变
在最初的研究中，Liu的团队发现CBE可以纠正与老年痴呆症和癌症相关的点突变。已知CRISPR-Cas9的编辑效率仅为0.1-0.3%，删除或插入随机碱基的概率为26% – 40%。相比之下，CBE在人类细胞系中的目标编辑效率达到了35-75%，且删除或插入随机碱基的概率仅为5%。利用ABE，Liu的团队纠正了可能导致一种危及生命的血细胞疾病（遗传性血色素沉着症）和镰状细胞贫血症的点突变。
研究人员已经开始使用碱基编辑器来创建和纠正人类疾病的动物模型，包括杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy）、成人早衰综合征（progeria）和与年龄相关的黄斑变性。黄兴旭表示，有了碱基编辑器，很容易建立动物模型，并探索全基因组的致病性突变。他已经建立了多种疾病的小鼠模型，如雄激素不敏感综合症和指状指畸形（多个手指或脚趾融合在一起）。黄兴旭甚至能够在相同的小鼠胚胎中联合使用CBE和ABE，从而同时进行A-G和C-T的编辑，这是他使用具有不同序列偏好的编辑器实现的一个技巧。黄兴旭还表示，他们可以同时处理多个突变，而且效率非常高。
碱基编辑器也可以用来产生基因敲除。CRISPR-Cas9系统尤其擅长于产生敲除，这得益于最常用来修复双链DNA断裂的自然机制。这个过程可以在切割位点上添加或删除碱基，导致基因序列被误读，导致蛋白质合成提前停止。但是CBE可以直接将某些密码子（定义蛋白质中氨基酸序列的三碱基遗传密码）转换为停止信号，研究人员正在利用这一想法来系统地测试敲除基因组中不同基因的效果。随着碱基编辑器在临床试验方面的进展，研究人员已经开始在非人类灵长类动物身上进行试验。在未发表的论文中，中国科学院上海生命科学研究院的发育生物学家杨辉将碱基编辑应用于小鼠和猴子模型中，如与年龄相关的黄斑退化、杜氏肌萎缩症和帕金森病模型中。杨辉指出，碱基编辑器只会导致单链断裂，而不是双链断裂，所以他真的认为该编辑器比CRISPR更安全。
中国科学院遗传与发育生物学研究所的植物生物学家高彩霞表示，碱基编辑器也可以用来创造高产或抗病的植物品种。她指出，例如，单一的核苷酸变化可以使一些水稻更好地利用地里的氮。
构建更好的编辑器
虽然在理论上碱基编辑器类似于基因搜索和替换工具，但在实践中，它的精确度并没有那么高。
碱基编辑使用Cas9靶向序列目标，这一事实意味着它可以产生偏离目标的编辑，就像CRISPR-Cas9一样。但是碱基编辑器的特异性由于脱氨酶而变得复杂，而脱氨酶实际上改变了DNA。这些酶可以在目标位点以外的位点修饰RNA和单链DNA。Liu指出，他们不知道这些影响是否与临床相关，但尽量减少不必要的编辑是明智的。
ABE显然没有显示出这种偏离目标的效果。Liu指出，这可能是因为与CBE脱氨酶相比，ABE脱氨酶对靶标的结合更弱，因此需要Cas9的帮助才能进行有效的编辑。研究人员现在已经开发出了高保真度的CBE，如HF-BE3，其目标结合较弱，并发现它们的脱靶编辑水平相应较低。
碱基编辑器有时也可以编辑“旁观者”（靶标位点以外）的C或位于其“编辑窗口”（即酶有效工作的核苷酸区域）内的C。研究人员创造了窗口更窄或更宽的编辑器来增强或减少这种影响。例如，YE1-BE3和YEE-BE3是BE3的升级版，编辑窗口较窄，而ABE7.9和CBE BE-PLUS的编辑窗口则较宽。
高彩霞表示，如果考虑纠正遗传病基因，那么我们就需要非常具体的编辑，需要把编辑窗口定义得非常窄，缩小到只有一个核苷酸的范围。但是一个扩展的编辑窗口对于访问多个目标位点可能很有用，例如一次引入几个点突变。
碱基编辑器在可以针对的基因组位点方面也相对有限：它们只能在前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）附近发挥作用，PAM是Cas9与DNA靶标成功结合所需的短DNA序列。由于这一限制，黄兴旭指出，他相信目前的工具只能精确编辑或纠正人类基因组中大约25%的致病突变。研究人员通过使用定向进化来创建识别更广泛的PAM的Cas9蛋白，并将碱基编辑器融合到具有更广泛PAM兼容性的Cas9变体，扩大了碱基编辑器的编辑范围。
还有一个问题是，碱基编辑工具目前所能做出的碱基修改范围有限。要纠正尽可能多的遗传疾病的点突变，碱基编辑器将需要执行额外的转换，如C转化成A，C转化成G，A转化成C以及A转化成T。大田基础科学研究所（Institute for Basic Science in Daejeon）的生化学家Jin-Soo Kim，今年证明了可以在人类肾脏细胞系中实现C到G的转换以及C到T的转换。他表示，这些结果为我们提供了一个如何制作其它类型的碱基编辑器的提示。
或者，研究人员可以使用来自Liu实验室的一种新的基因组编辑器，名为prime editor。它可以把任何DNA碱基变成任何其它碱基。Prime editor使用一种特殊的引导RNA模板和Cas9切割酶来引导逆转录酶结合到目标位点。然后，这种酶从RNA模板中制造出一条新的DNA链，并将其插入目标位置（图“Prime纠正”）。但是这些工具还有很多未知之处，Liu指出，包括我们是否能成功地对动物进行Prime编辑，以及它是否能像碱基编辑一样对许多不同类型的细胞都适用。
有了所有这些不同的工具可供选择，研究人员将需要仔细考虑他们的需要，找到最适合自己项目的工具。Liu表示，针对有效干扰基因或插入或替换大段DNA序列，CRISPR-Cas9是最佳选择。它已被很好地研究，有许多具有更大的特异性或特定的PAM亲和性的变体，并且已经在临床试验中进行了测试。Prime editor为创建DNA插入、删除、点突变或其组合提供了最大的灵活性。而碱基编辑器是纠正点突变、提高效率和减少插入的理想工具。
Liu认为这三种基因编辑工具确实各有优缺点。他把CRISPR-Cas9比作剪刀，把碱基编辑器比作铅笔，把prime editor比作文字处理器。Liu认为它们在农业和人类治疗等研究和应用中都有各自的角色，就像剪刀、铅笔和文字处理软件都有各自有用和独特的角色一样。
像CRISPR一样简单
就像剪刀、铅笔和文字处理软件一样，碱基编辑已经被科学界迅速采用，因为它的使用门槛很低。Kim表示，如果你很熟悉基因编辑技术，那么你就能很快掌握碱基编辑技术。
研究人员可以从非营利性质粒库Addgene上订购碱基编辑器。Liu建议从一些最新的编辑器入手，比如他的实验室的BE4Max和ABEMax，它们分别针对C和A。但他补充，根据具体情况，其它许多公司也可能符合这一要求。
Liu表示，在选择时要充分考虑PAM的特异性和目标序列所需的编辑窗口。还要优先考虑减少脱靶效应。像beditor这样的专用计算工具可以帮助研究人员为他们的特定目标设计向导RNA。
不过，碱基编辑器并不总是按预期工作。Komor表示，有时他们必须测试不同的编辑工具，然后才能找到一个与目标结合的编辑器。如果无效，研究人员可以从不同的碱基编辑器中剪切和粘贴来制作一个定制编辑器。这个过程相对简单。不要害怕自己动手。
无论是哪种编辑器，将它们导入细胞都需要标准的遗传技术，如转染、微注射和电穿孔。Liu提醒，你可以将它们以蛋白质- RNA复合物、mRNA或DNA的形式传递。然而，治疗应用将需要一种不同的方法。
传统的病毒载体，如腺相关病毒（AAV）只携带尺寸较小的基因载体，而碱基编辑器通常太大而无法被加载。杨辉指出，他们目前的工作目标是缩小Cas9和碱基编辑器的尺寸，他认为这将扩大其应用范围。或者，研究人员可以将碱基编辑器分成两个拷贝，就像Kim在靶向成年老鼠中杜氏肌营养不良症的致病突变时所做的那样。他们能够纠正骨骼肌的突变。
虽然现在还处于早期阶段，但是碱基编辑器已经成为基因组编辑工具集的一个有前途的补充。他们可能还有更多的技能。例如，一些编辑器可以作用于RNA而不是DNA，这为敲除或编辑含有致病性突变的mRNA转录提供了可能性。同时，Kim指出，线粒体缺乏传统基因组编辑所依赖的DNA修复途径，因此CRISPR-Cas9无法靶向线粒体突变，但碱基编辑器可以。对Gaudelli来说，这样的机会代表着毕生梦想的实现。虽然她从事科学工作的初衷就是要改变世界，但她从来没想过所使用的方式是碱基编辑。
原文检索：
Sandeep Ravindran (2019). Got mutation? ‘Base editors’ fix genomes one nucleotide at a time. Nature, 575: 553-555.
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