单分子检测：生物检测领域的颠覆者
原创： 智银医药 2019-4-22
作者 | 智银资本
摘要
★ 单分子检测是生物标志物检测领域的颠覆性技术；
★ 目前全球范围内，已商品化的单分子免疫检测的技术平台仅有Quanterix公司的Simoa系统和Merck的SMC系统；2个系统通过不同的原理实现了单分子检测；
★ 单分子检测的最大特点是超高灵敏度，可达fg级别，是传统ELISA的1000倍；
★ 单分子检测在“传统标志物的再次发现”、“新标志物的开发”以及“新药研发（PK&PD）”等领域具有重要应用价值；
★ 除了免疫诊断领域，单分子检测技术在分子诊断领域同样具有重要的作用。由于不需要通过扩增即可实现高灵敏度检测，单分子检测技术可以大大降低分子诊断的检测时间以及气溶胶污染风险；
★ 单分子诊断技术还存在一些问题（工艺要求、特殊配套试剂、检测时间）有待解决。
什么是单分子免疫检测技术？
单分子免疫检测是蛋白生物标志物检测领域的颠覆性新技术，是指通过免疫标记的方法，利用抗体捕获和识别抗原，进行信号分子标记或是酶联标记的形式，通过单分子荧光信号检测或单分子酶促反应实现的单分子级别蛋白分子的检测，其检测灵敏度是ELISA的1000倍。
技术原理——Simoa系统和SMC系统
目前全球范围内，已商品化的单分子级别免疫检测的技术平台仅有Quanterix公司的Simoa系统和Merck的SMC系统。
Simoa技术原理：Simoa检测的生物学原理仍然是经典的免疫反应-双抗夹心法，所不同的是，Simoa技术将约250,000个捕获抗体包被在2.7μm的小磁珠上，检测时加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物，通过一层油将单个磁珠分别封闭在238,000个4.5μm的反应孔（Well）中进行反应。由于每个小孔的反应体系仅仅为50飞升，比传统ELISA小20亿倍，这时小孔中即使只有一个分子，其催化底物就可产生3000个荧光分子，通过CCD摄像头即可捕获到信号，利用泊松分布理论可计算出阳性荧光小孔（OnWell）对应的蛋白浓度值，实现数字化单分子检测的愿望。
SMCTM技术原理：与SiMoA通过降低反应单元体积，浓缩荧光产物的思路不同，SMC采取的是更为直接的通过激光聚焦的形式提高免疫标记的少数几个荧光染料分子的光子产量，来实现单分子的计数检测。光闪烁信号的次数和强度与分子浓度呈正相关性，从而能建立标准曲线。通过对一定时间之内光闪烁信号进行统计，可以对溶液浓度进行定量检测。
单分子免疫检测的特点——超高灵敏度
单分子免疫检测的最大特点就是超高灵敏度，其灵敏度可达fg级别，一般的标记免疫技术（化学发光、荧光免疫等）最高的检测灵敏度一般在pg级别。
临床/研究意义和应用
不论临床还是基础研究，蛋白生物标志物的应用都拥有可观的发展前景。据统计，在40,000多种已知的人类蛋白中，约有30,000种因表达丰度过低而无法实现传统方法的检测。大量蛋白生物标志物的重要功能，如同海平面下的冰山，无法被现有技术准确界定。
单分子检测技术所具有的超高灵敏度，可以用于传统标志物的“再次发现”、新标志物的开发以及支持新药研发（PK&PD）。
★ 传统标志物的“再次发现”：肌钙蛋白cTnl是心脏病领域经典的生物标志物。cTnl的检测被用来判断冠心病、心衰等心脏疾病的发生和预后评估。正常人血液无法通过ELISA有效测得cTnl指标，因此一般认为这种因子在正常人中并不存在。但通过单分子免疫检测技术发现，在350例健康的男性和女性个体中，几乎所有个体血液中的cTnl都可被精确检测，并且99%个体的表达水平都在10.19pg/mL以下。在一项长达12年的连续研究中，cTnl的价值被彻底地重新定义，研究揭示本底表达cTnl较高的个体倾向于较高的累积心病发病率，而本底表达丰度低于1.06pg/mL的个体12年后心脏病的累积发病率极低。
★ 新标志物的开发：通过传统技术，极低水平的神经学生物标志物只能在脑脊髓液中检测到。单分子检测技术能够检测血液中极低水平的神经学生物标志物，为改善脑损伤和脑病的诊断方式提供可能。另外，单分子检测能于更早的阶段检测出与脑损伤和脑部疾病有关的神经学生物标志物，从而了解疾病的长期影响和病理，研究针对于神经退行性疾病、神经炎症、创伤性脑损伤和多发性硬化症等。
★ 支持新药研发（PK&PD）：Pfizer辉瑞制药在开发用于治疗哮喘的IL-13单克隆抗体药物时，有两个候选药物（IMA638和IMA026）获得了比较好的疗效。但临床实验急需方法测量血液中的IL-13进行药物代谢动力学和药物效应动力学的检测，这些关键数据对于药物通过临床实验，进入FDA审批起着至关重要的作用。普通的ELISA受制于较低的灵敏度，无法检测到IL-13的本底表达水平。辉瑞借助单分子免疫检测的超高灵敏度，实现了所有个体本底表达水平的检测，从而得到了血液中IL-13在治疗条件下的完整变化数据，提供了关键的临床证据。
单分子检测在分子诊断领域的应用
目前分子诊断领域主流的检测技术均需通过PCR扩增实现高灵敏度检测，而单分子检测技术通过分子杂交的方法，不需要经过核酸扩增，完全可以实现pM（与PCR近似灵敏度）以下甚至接近fM水平核酸分子的检测。这种检测形式除了可以显著降低分子诊断所需时间，还可以彻底解决目前分子诊断中最为麻烦的问题——气溶胶污染，从而显著降低分子诊断实验室的环境控制要求。
另外，由于单分子检测技术统一了分子检测与免疫检测在方法学上的根本差异，相信随着该技术的不断成熟，有望实现分子检测与免疫检测的一体化。
存在的问题
单分子检测技术作为一种全新的蛋白和分子检测技术，有望成为未来10年里最具突破性的检测技术。但由于其发展时间相对较短，还存在一系列亟待解决的问题。
★ 对制造工艺和精度要求较高：SiMoA系统使用了接近微米加工体系极限的3μm微孔阵列，加工精度要求高、生产成本高昂；而SMC技术中应用的艾里斑处于光学衍射极限，这使得设备对光学系统的调校精准程度和设备操作环境的稳定性都有着极为严苛的要求；
★ 需要专门的配套试剂：SiMoA系统对于微球的大小和均一程度有着极高的要求，一般粒径要求为2.7um，尺寸太大的微球会导致微球无法进入3μm的微孔，尺寸太小又会导致同一个微孔阵列中落入多个微球；而SMC技术的检测窗口很小，检测窗口的液体通道极易堵塞，需要使用专门过滤处理过的洗脱溶液；
★ 检测时间较长：SiMoA检测系统单次检测耗时长达1小时以上，远超过目前免疫诊断市场中已经能轻易实现的15分钟报告时间；二代SMC系统单次检测超过4个小时。
讨论
★ 单分子检测技术目前尚处于早期阶段，主要应用于科研市场，但凭借着超高灵敏度，可以用于发现更多生物标志物，极大扩容体外诊断市场；
★ 化学发光技术目前已成为临床应用的主流免疫检测技术，单分子目前还主要用于科研市场，短期内两者更多的表现为互补作用，但随着单分子检测技术的成熟（成本、检测时间、自动化程度等性能的不断完善），长期来看单分子检测对化学发光将更多的表现为替代作用；
★ 对于分子诊断领域，单分子检测技术虽然通过免扩增，大幅降低了检测时间以及气溶胶污染风险，但也在一定程度上牺牲了检测灵敏度，对于现有的分子诊断技术更多的表现为互补作用。
（完）
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