使用 Primer-Blast 比对引物的特异性

负70度思考 2018-06-26，转自：生工生物

什么是引物的特异性

引物是一段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退火阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3末端向后进行DNA的合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，因此，当退火温度不合适或引物设计不合理时，引物会结合到模板的非目标区域，从而导致其他片段的扩增。

所谓引物特异性，就是引物结合模板正确位置的能力，或者避免结合非目标位置的能力。引物的长度、GC含量、碱基分布、Tm值等性质，均会影响其特异性。

 

Primer-Blast比对引物特异性的原理

NCBI收录了诸多物种的基因组DNA、编码序列mRNA以及其他相关核酸序列的数据。使用Primer-Blast进行比对，首先要输入一对引物序列，并选择序列所属数据库。此时系统将在该数据库中对序列进行查找和对比，并将引物可能结合的位置进行记录，一旦结合位置处于两条链并且产物大小符合要求，系统就会将这种情况列举到结果中。需要注意的是，结合模板的引物不仅是一条正向一条反向，也有可能是两条正向或者两条反向引物。

 

Primer-Blast比对引物特异性的步骤

打开NCBI，进入Blast，

点击Primer-Blast，在界面引物序列处，将正反向引物序列粘贴进去，5-3方向。产物大小默认为70~1000，可以根据实际情况进行调整。

选择相应的物种和参考数据库。

首先，要确保Specificity check一栏中已经打勾。Search mode一般选择Automatic即可。

物种：人源的基因选择Homo sapiens(taxid:9606)；小鼠的选择Mus musculus (taxid:10090)；大鼠的选择Rattus norvegicus(taxid:10116)。

参考数据库：要看PCR的模板是什么，如果是提取的RNA反转录后得到cDNA就选择Refseq mRNA（针对mRNA）或Refseq RNA（针对mRNA和lncRNA）；若模板是基因组，则应该选择Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以对预测的序列以及环境/不可培养样本序列的干扰。

选好数据库和物种后点击页面左下角的Get Primers，系统进行分析，一段时间后会进入如下页面：（该页面以一对人EGFR的qPCR引物为例）。

每个结果分为多个部分：

第一部分为比对出来的基因结果；对于mRNA数据库，提供了该mRNA的NM号，对于基因组数据库，则会显示出基因组编号，点进去会出现预测的产物序列。

第二部分为预测出来的产物大小。

第三部分为正反向引物和模板的结合形式，“点”代表该位置的序列和模板完全互补配对。

对于非特异性结果的判断

对于常规PCR，产物可以通过凝胶电泳对非特异性条带进行分离，引物的非特异性并不是很重要，但是对于SYBR Green染料法荧光定量PCR，引物的特异性则非常重要。

但是，并不是说预测出了非特异结果，引物的性质就一定不好，需要具体情况具体对待：

首先，引物的3端对扩增效率的影响是非常大的，如果预测出的非特异性结果中，3端存在不匹配碱基，说明即使引物能够结合模板，但3端会翘起，导致无法扩增，这一类的非特异结果可以忽略。

其次，PCR的产物大小是有限制的，尤其对于qPCR，由于延伸时间非常有限，大于1000的产物是基本上无法扩增出来的，如果非特异性产物远大于目的产物大小，这种非特异性结果也是可以忽略的。

Primer-Blast比对引物特异性的意义

当然，任何引物工具或者软件，都是根据一定的参数和算法进行的预测，结果只是起到了参考、建议的作用，并不能代表该引物的实际使用情况。

特性好的引物在实际使用过程中不一定表现优秀，反之预测特性不好的引物也不一定不能使用。一对引物究竟好不好用，最终还是要通过实际实验来验证的。也正是因为如此，生工生物免费引物设计服务是默认不经过Primer-Blast的。

但也不是说Primer-Blast一点实际意义没有，比如在上述EGFR案例，可以准确判断一对引物是否能够将该基因的所有转录变体覆盖到。NCBI的引物设计工具凭借基因序列直达引物设计的入口、其丰富的设置选项、特异性预测的功能还是得到了广大科研工作者的青睐，熟悉掌握了该工具，将为您的分子生物学实验起到很大帮助。

 

转载出自“负70度思考”，如有侵权请及时联系。