利用mRNA的3′ 末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成cDNA第一链，用RNase降解模板mRNA。然后用一个基因特异引物GSP1（Gene specific primer）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal primer mix）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3′ 末端的DNA片段扩增出来^[4]。（图1）

利用mRNA的3′ 末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）₃₀MN作为锁定引物在逆转录MMLV酶，由GSP1引发逆转录生成cDNA第一链。将RNA-DNA杂合链用RNase降解模板链mRNA纯化cDNA第一链，利用末端脱氧核苷酸转移酶在cDNA链的3′ 端加入连续的PolyC尾巴，用一个含有部分接头序列的通用锚定引物UPM作为上游锚定引物和一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5′ 末端的DNA片段扩增出来，用巢式PCR检测^[4]。（图2）

最后从2个有相互重叠序列的3′ 和 5′ 末端RACE产物中获得全长cDNA或分析3′ 和 5′ 末端RACE产物序列合成相应的引物扩增出全长cDNA 序列。

（1）提取RNA的菌液、细胞或组织样品，要确保新鲜足量。

（2）在RNA提取过程中应注意RNA的完整性和纯度，防止RNA降解。

（3）使用嗜热DNA聚合酶进行反转录，消除5’端因高GC含量导致mRNA二级结构对逆转录的影响，减少截短的cDNA 产生。

（4）选择适合的RACE技术扩增目的片段。

（5）选择适合的加尾碱基，在oligo（dT）引物3’末端使用引发效率高的碱基如CC、GG、CG、GC。

（6）使用高特异性引物进行PCR反应。

（1）制备和抽提polyA+RNA，使用灭菌的蒸馏水，不要使用DEPC处理过的水。

（2）纯化完mRNA后用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。

（3）3’RACE需要的RNA>15 μg,5′ RACE需要的RNA＞25 μg。

（4）DNA的合成起始于polyA+RNA，如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

（5）Race引物设计：碱基16-22 bp，GC含量控制在50%-70%，Tm值在50-60 ℃。（具体条件根据使用的试剂盒设定）

（6）如果用重叠片段检测设计的引物，GSP1和GSP2之间至少100-200个碱基。

（7）采用SMART-RACE热启动PCR和降落PCR来提高PCR反应的特异性，降落PCR要求GSP的Tm值≥70℃。

（8）降落PCR在最开始的循环，退火温度应高于AP1引物的Tm值。

（9）当循环结束时，用2%的琼脂糖凝胶电泳分析产物，制备1.2%的TAE buffer琼脂糖凝胶。

（10）利用胶回收试剂盒回收3-4 kb的RACE产物，长的片段使用电洗脱方法。

（11）第一轮扩增为不对称PCR，PCR扩增时使用的两种引物浓度不同,一般高浓度引物与低浓度引物的浓度比为50-100:1；在不对称PCR中最初10-15个循环的产物主要是双链DNA，待低浓度引物耗尽后,继续由高浓度引物介导产生大量单链DNA。

（12）如果已知序列较短，先进行3′ RACE，再进行5′ RACE。

Q1: 模板中有特殊二级结构，反转录提前终止？

A1: 提高反转录温度、加大反应体系，将反转录过程中易、已变性的RNA模板一直保持在50℃以上，避免已解开的二级结构的RNA再恢复原来的结构，扩增到5′ 末端。

Q2: RNA质量？

A2: 含有目的基因高表达的RNA或组织，在RNA提取的过程中避免降解，注意RNA的完整性。

Q3: RACE-PCR扩增，PCR产物无条带或只有微弱条带?

A3: 将PCR反应管重新放进PCR仪中，在68 ℃多加5个循环；若片段长度为2-5 kb，延伸时间4 min，0.2-2 kb，延伸时间为2-3 min，5-10 kb，延伸时间为10 min。

Q4: 有非特异性扩增？

A4: 重新设计特异性引物。

优点：克隆全长cDNA费用廉价、实验周期短、操作步骤简单。

局限性：5′ 末端RACE在逆转录、TdT同聚物加尾、PCR扩增这三个酶促反应，每一步反应失败都会影响最终结果^[6]；3个酶促反应顺利进行，结果也经常会出现一些非特异性产物和非全长的产物，因此需要不断优化实验方案提高产物的特异性；克隆长片段或低丰度的基因时效率低^[7]。

测序结果与已知序列重叠；数据库同源序列的比对。

仪器：分光光度计；PCR仪；紫外照射仪；电泳仪；照胶仪；离心机等。

试剂：RNA提取试剂；反转录相关试剂；RACE相关试剂盒等。