技术概述
定点突变（Site-directed mutagenesis，SDM）是指按照人们的意愿在体外对基因的特定编码区和表达调控区定向发生缺失、插入或碱基替换等变异过程。体外定点突变的方法有寡核苷酸介导的定点突变、PCR介导的定点突变和盒式突变[1]。寡核苷酸定点突变指用含有突变碱基的寡聚核酸片段为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制，合成新的有突变碱基序列的DNA新链。盒式突变又称为片段取代法，是用一段人工合成具有突变序列的寡核苷酸片段，变性退火后产生粘性末端，取代野生型基因中相应序列[2]。PCR介导的定点突变主要采用重组PCR进行定点突变，首先通过引物设计在扩增片段的末端引入错配碱基，再通过重叠延伸PCR（Splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）将两个末端相互重叠且都含有相同突变的片段进行拼接，将突变位点导入扩增片段的内部[3]。定点突变技术根据突变位点数目又分为单点突变和多重突变。
基因的定点突变主要应用于研究蛋白质结构和功能[4]；改造启动子或DNA作用元件[4]；识别或改造酶的活性位点；提高蛋白的抗原性、稳定性和晶体研究[5]；药品的研发及基因治疗[5]等。
技术详情
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
设计定点突变引物和扩增突变基因全长引物→准备模板DNA→PCR扩增突变位点及两侧序列→用酶消化PCR产物中的甲基化质粒→回收两端PCR片段→重组PCR→转化→菌落PCR鉴定阳性克隆→测序分析。
定点突变引物设计；PCR反应；DpnI酶处理PCR产物。
（1）设计同一方向完全互补的定点突变引物，长度为 25-45 bp，一般都是以要突变的碱基为中心，各加上两边的长度至少为 10–15 bp的一段序列；突变引物GC含量应大于40%，Tm ≥78℃且引物的3’端以G或C结束。
（2）定点突变引物用高核苷酸液相色谱（FPLC）或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化。
（3）不使用普通的Taq酶进行扩增，因为会在PCR产物的3’端加A，会导致拼接片段产生移码突变，为了防止产生新的突变，使用高保真DNA聚合酶（如Pfu聚合酶等）。
（4）用DpnI酶处理PCR产物中甲基化质粒模板，处理时间至少一个小时将甲基化质粒去除干净。
（5）PCR产物进行切胶回收纯化，回收的PCR产物等浓度混合，作为扩增定点突变全长的模板。
（6）GC含量高的复杂模板，可以加入2%-8%的DMSO提高反应效率。
Q1：转化后平板上没有菌落或菌落数少？
A1：感受态细胞转化效率低，确保转化效率在108 cfu/μg以上；DpnI酶消化的产物用乙醇沉淀纯化，用少量的水溶解；转化进入感受态细胞中的DpnI消化产物少，提高转入感受态细胞PCR产物的量；抗生素浓度高，使用适当浓度的抗生素。
Q2：PCR产物凝胶电泳没有条带？
A2：检查引物是否设计错误；选择温度梯度退火，寻找最适退火温度；确保模板DNA的完整，提高PCR反应体系中模板的量或优化PCR反应条件。
Q3：样品诱变效率低？
A3：使DpnI酶消化PCR产物时间充足，延长消化处理时间，确保扩增中的原始模板被降解。
Q4：测序发现突变位点与设计不符？
A4：确定模板是否携带未知突变；引物设计不当，重新设计引物并提高退火温度。
Q5：转化后平板上的菌落多？
A5：DpnI酶消化PCR产物时间短，DpnI消化不完全，含有未突变的模板，应适当延长消化时间；抗生素失效，重新配置培养基并选择适当浓度的抗生素。
Q6：PCR产物有杂带无法确定目的条带？
A6：优化PCR反应条件，提高退火温度，增加特异性；适当降低PCR反应延伸时间；适当减少模板的量。
PCR胶图；测序结果等。
比较 | 寡核苷酸定点突变 | PCR介导的定点突变 | 盒式突变 |
优点 | 保真度高 | 操作简单、成功率高 | 简单易行、突变效率高 |
缺点 | 操作复杂、周期长；在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制 | DNA片段定点突变后续工作复杂，需要连到载体分子上才能对突变基因进行转录、翻译等研究；质粒进行定点突变，不能确定质粒载体上有无突变。 | 需合成多条引物，成本高；靶DNA 序列的两侧需要有合适的酶切位点。 |
试剂：质粒提取试剂盒；基因定点突变试剂盒；胶回收试剂盒等。
仪器：PCR仪；离心机；紫外照胶仪；超净工作台等。
1. 张浩等. 定点突变技术的研究进展[J]. 免疫学杂志, 2000, 16: 108-110
2. 张宝中等. 用DREAM技术进行全长质粒快速定突变[J]. 生物工程学报, 2009, 25: 306-312
3. 李海涛等. 猪TLR5基因定点突变表达载体构建[J]. 东北农业大学学报, 2012, 43: 11-15
4. 戴灿等. 基于重叠延伸PCR法的定点突变技术[J]. 现代生物医学进展, 2010, 10: 411-412
5. 严婉荣等. 3种基因突变方法在微生物中的应用研究进展[J]. 中国农学通报, 2012, 28: 179-184
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