技术概述
酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点，已广泛用于外源蛋白的表达， 其优势表现在：
1. 表达水平高，既可在胞内表达，又可分泌型表达；
2. 发酵工艺成熟，易放大；
3. 外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；
4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。因此，酵母表达系统为蛋白的生理活性研究提供了强有力的工具。
技术详情
毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源，甲醇代谢首先是醇氧化酶利用氧气将甲醇氧化为甲醛，由于醇氧化酶与氧气的结合率较低，导致毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子（AOX1和AOX2）。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓表型可分离 Mut+（methanol utilization plus） 和 Muts（methanol utilization slow） 菌株。
毕赤酵母能够高效的表达外源基因，是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子（AOX1和AOX2）。通过把构建的质粒/载体线性化（主要采用酶切），通过同源重组的方式整合到启动子AOX的下游，一般是插入到5’AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点，从而实现外源基因在毕赤酵母中的高效表达。
质粒/载体和酵母表达基因图谱
图1. 载体图谱：5’AOX1启动子位点，转录终止子TT，3’AOX1位点
图2. 酵母宿主菌基因
质粒载体上的PAOX位点（PAOX启动子）或PAOX转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点与酵母宿主菌基因发生同源重组。
在酵母宿主菌基因组的下游或者上游插入一个或多个质粒载体基因。如插入的质粒载体不破坏酵母宿主菌基因本身的AOX1，因此重组转化子的表现型不变为Mut+，反之为Muts。
图3. 重组质粒插入3’AOX1
质粒/载体基因替换酵母宿主菌的AOX1位点
酵母宿主菌的AOX1启动子位点被质粒/载体基因完全替代，原有的酵母AOX1启动子被破坏，表现型为Muts,取代其的是质粒/载体基因组上的PAOX，目的基因，HIS4表达序列。取代事件发生的不如基因插入事件发生的多。
图4. AOX1位点被替换
多拷贝插入
简单来说就是质粒/载体基因的多次插入（插入到酵母宿主菌基因组上），自发概率很低。
图5. 多拷贝插入
（1）创新蛋白修饰赋能平台
独创共表达修饰酶技术突破真核蛋白表达的关键瓶颈——翻译后修饰不足。通过对毕赤酵母菌株进行改造，构建了羟基化酶、二硫键异构酶稳转株，并实现其与目的蛋白的共表达，成功实现了目的蛋白的高效羟化修饰。这一突破性技术不仅解决了复杂真核蛋白的翻译后修饰难题，还显著提高了重组蛋白的生物活性和稳定性，为产品质量的提升提供了关键技术支持，使重组蛋白在医药、化妆品等领域的应用价值得到大幅提升。
（2）前瞻性系统研发与进化能力
通过开发新型信号肽提升目的蛋白表达效率，并积极探索多基因共表达体系以实现更复杂的蛋白翻译后修饰，拓展重组蛋白的应用领域。通过不断优化表达系统和探索新的表达策略，来满足不同客户对重组蛋白在表达量、修饰类型、活性等方面的个性化需求。
（3）深度定制全方位解决方案
超越简单的订单执行，提供以客户应用目标为导向的深度定制服务。从前期目标蛋白的特性分析、表达策略的个性化设计，到后续的蛋白纯化方案优化，均能根据客户的项目目标和应用场景进行灵活调整。多基因共表达体系和复杂蛋白修饰技术进一步增强了定制化服务能力，能够满足不同行业客户对复杂重组蛋白的多样化需求，为客户提供从实验室研发到中试生产的一站式技术服务支持。
（1）重组酵母表达质粒构建；
（2）重组质粒线性化；
（3）毕赤酵母感受态细胞制备及转化；
（4）筛选阳性高表达单克隆菌株；
（5）优化蛋白表达条件；
（6）大量蛋白表达、纯化及检测。
在毕赤酵母中表达蛋白A，采用独有的改造后的GS115酵母菌株及表达载体进行小量表达（2ml体系）筛选高表达菌株，图1中1-11为PCR鉴定阳性菌株表达样品，负为未转化菌株培养样品。挑选其中高表达菌株进行放大培养，纯化蛋白检测结果如图2所示，其中纯1，纯2为洗脱纯化蛋白。
图1. 蛋白A毕赤酵母小量表达SDS-PAGE检测
图2. 蛋白A毕赤酵母表达纯化蛋白SDS-PAGE检测
（资料来源：金小峰 ）
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