ALL SEQ-DNA Protein Interactions(四)

1.PB_seq

蛋白质/ DNA结合后跟随高通量测序

PB_seq是一种DNA结合分析，可以在没有染色质的情况下在全基因组范围内表征DNA蛋白结合能量景观 （Guertin等，2012）。它属于通常通过指数富集（SELEX）系统进化配体的方法家族 （Ozer等，2014）。对基因组DNA进行超声处理，大小选择和纯化。在与DNA结合蛋白杂交后，分离，提取蛋白质结合的DNA并制备用于测序。

好处：

确定与染色质结构无关的结合效率

缺点：

尚未被科学界广泛采用

2.Pu-seq

聚合酶使用测序

Pu-seq提供直接的复制起源位置和效率数据，以及复制时间的间接估计 （Daigaku等，2015）。

含有双链核糖核苷酸的DNA的碱处理导致磷酸骨架对核糖的裂解3'，产生5'羟基末端。如果变性DNA用作随机六聚体引物延伸的模板，则5ê至3ê合成导致邻近初始核糖的齐平末端。通过从单链DNA产生文库并在每个末端放置不同的索引引物，可以将测序读数定位到单个链，以确定具有单碱基准确度的原始核糖核苷酸位置。

好处：

单基准确度

缺点：

仅适用于酵母

3.SELEX or SELEX-seq / HT-SELEX

通过指数富集的指数富集/高通量配体系统演化的配体的系统演化

自1990年3个独立小组描述第一次SELEX实验时 （Ellington等，1990） （Tuerk等，1990）（Sullenger等，1990），该方法适用于广泛的范围技术 （Chen et al。，2016） （Takahashi et al。，2016）。为NGS开发了一种高度多路复用的并行HT-SELEX方法 （Jolma等，2010）。SELEX-seq的变体 （Slattery等，2011） 使用Nextera衔接子序列进行有效的文库制备 （Zhang等，2016）。

在该方法中，蛋白质表达为与pD40htSELEX表达载体中与高斯荧光素酶缀合的链霉抗生物素蛋白结合肽（SBP）的融合体。每个DNA配体含有14bp随机区域（14N）和5bp条形码，其单一地识别单个SELEX样品。部分嵌套的引物用于连续的SELEX轮次。将含有所有可能的14bp序列的双链DNA混合物与固定在96孔板的孔中的DNA结合蛋白一起温育，导致DNA与蛋白质结合。洗涤和洗脱后，通过PCR扩增得到的更具特异性序列的群体并测序 （Caroli等，2016）

好处：

高通量和高效率

软件管道可用 （Hoinka等，2016）（Caroli等，2016）

缺点：

可能包含序列偏差

4.HITS-FLIP

采用荧光配体相互作用分析的高通量测序

HiTS-FLIP是一种在前所未有的深度测量定量蛋白质-DNA结合亲和力的技术。在该方法中，内置于高通量测序仪中的光学器件用于可视化蛋白质与流动细胞中测序的DNA的体外结合 （Nutiu等人，2011）。

通过合成对具有锚定的单链DNA的微流体流动细胞进行测序。剥离第二链DNA并使用Klenow聚合酶和未修饰的dNTP重建以形成双链DNA簇。以不同浓度引入荧光标记的结合蛋白，并对结合进行成像。

好处：

量化和全面

缺点：

需要专门的硬件

尚未被科学界广泛采用