通过将着床前阶段的胚胎细胞转移到培养皿的培养基中，通常使用一层小鼠胚胎皮肤细胞作为饲养层。饲养细胞为胚胎干细胞提供了附着位置并且可以释放营养物质到培养基中。

研究人员设法在没有饲养细胞的情况下培养胚胎干细胞以降低危害风险，例如病毒感染。虽然这种方法生成胚胎干细胞系的过程有些低效，但如果铺板的细胞存活，分裂，而且增殖足以覆盖培养皿的表面，那么就可以轻轻地将它们移入几个新的培养皿中进行扩增。当在细胞培养中增殖很长一段时间而没有分化而且也保留了多能性，那么胚胎干细胞就可以被看作是一种细胞系。

只要胚胎干细胞在合适的条件下生长，它们可以持续保持未分化状态。条件不适时培养胚胎干细胞会导致细胞凝集或拟胚体的形成，而且会自发分化。虽然自发分化暗示培养的胚胎干细胞是健康的，但是如果它们是作为一种特定细胞来源的话，这即代表了定向分化的失败。

为了产生特定的细胞类型，必须控制胚胎干细胞的分化。这可以通过许多方法实现，比如，改变培养基成分、改变培养皿的表面性质、或者通过导入特定的基因修饰细胞。

成体干细胞只有有限的分裂能力，它们在正常组织中的低分裂频率使得大量获得目的细胞成为一个巨大的挑战。