技术概述
植物基因工程是以植物为研究对象，按照人们的意愿，将人工分离和修饰过不同生物的目的基因，在生物体外对DNA分子进行经过剪切、拼接、修饰和重新组合，然后转到植物受体细胞基因组中，进行组织培养和无性繁殖，使目的基因在受体细胞中复制并表达，引起植物性状发生可遗传的改变。[1]
植物表达载体在植物基因工程中起着至关重要的作用，构建植株表达载体主要目的是将目的基因进行修饰改造，使其转入受体植物后的表达符合目的需要。目前常用于植物基因表达载体构建的载体，有过表达载体，干扰载体，启动子活性分析载体，亚细胞定位载体等。构建植物表达载体可以进行基因功能验证和转基因工程的应用。
技术详情
将目的基因构建到含强启动子如35S、Lac、Nos等表达载体，通过根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA系统，将目的基因整合至植物基因组中，实现目的基因在植物体内过量表达，从而进行特定的功能或者表型观察研究。
载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
pBI121 | CaMV 35S | GUS | 卡那霉素 | ,新霉素 | 可供构建 |
pBI121-mCherry | CaMV 35S | mCherry | 卡那霉素 | 新霉素 | 可供构建 |
pBI221-GFP | CaMV 35S | GFP | 氨苄青霉素 | / | 可供构建 |
pBI101 | Lac | / | 卡那霉素 | GUS | / |
pBI121-GFP | CaMV 35S | N-10xHis, N-EGFP，C-6xHis | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pBI221 | CaMV 35S | GUS | 氨苄青霉素 | / | / |
pROKII | CaMV 35S | / | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
pCAMBIA1300 | Lac | / | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1301 | CaMV35S,Lac | GUS,6xHis | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1302 | CaMV35S | mGFP5,his | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1301-35S-NOS | CaMV35S | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1300-35S | CaMV35S |
| 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1300-35S-3×Flag | CaMV35S | 3×Flag | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1304 | CaMV35S,Lac | mGFP5,GUS,6×His | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA3301 | Lac，CaMV35S | GUS,6×His | 卡那霉素 | 草丁膦 | 可供构建 |
pCAMBIA1303 | CaMV35S,Lac | mGFP,GUS,6×His | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pCAMBIA1305 | CaMV35S,Lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pCAMBIA2300 | Lac | / | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pCAMBIA2301 | Lac | GUS,6×His | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pCAMBIA3200 | Lac | / | 氯霉素 | 草丁膦 | / |
pCAMBIA3201 | Lac | GUS | 氯霉素 | 草丁膦 | / |
pCAMBIA3300 | Lac | / | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
pB7WG2 | CaMV35S | / | 氯霉素 | 草丁膦 | / |
pDONR201 | / | ccdB | 卡那霉素/ 氯霉素 | / | / |
pDONR207 | / | ccdB | 卡那霉素/庆大霉素 | / | / |
pDONR221/Kan | T7 | ccdB | 卡那霉素 | / | / |
pDONR221/Zeo | T7 | ccdB | 博来霉素 | / | / |
pEarleyGate100 | CaMV35S | / | 卡那霉素 | 草丁膦 |
|
pEarleyGate101 | CaMV35S | EYFP,C-HA | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
pEarleyGate102 | CaMV35S | ECFP,C-HA | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
pEarleyGate205 | CaMV35S | CBP,TEV,N-2×PortA | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
pENTR3C | / | ccdB | 卡那霉素 | / | / |
pGWB4 | / | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素/遗传霉素 | / |
pGWB11 | CaMV35S | C-FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素/遗传霉素 | / |
pGWB12 | CaMV35S | N-FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素/遗传霉素 | / |
pGWB17 | CaMV35S | C-4×Myc | 卡那霉素 | 潮霉素/遗传霉素 | / |
pGWB18 | CaMV35S | N-4×Myc | 卡那霉素 | 潮霉素/遗传霉素 | / |
pK7GWIWG2(I) | CaMV35S | / | 壮观霉素 | 卡那霉素 | / |
pKGWFS7.1 | / | EGFP,GUS | 氯霉素 | 遗传霉素 | / |
CRISPR/CAS9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性，当外源核酸入侵时对其靶向定位并降解，首先CRISPR间隔序列获得和整合，其次CRISPR座的表达，然后CRISPR-CAS9发挥功能对外源核酸进行干扰,从而对基因位点进行切割导致突变[3]。CRISPR/CAS9技术在植物研究上主要用于创制植物基因功能缺失突变体，进行基因功能的研究。
载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ | CaMV 35S | C-SV40 NLS | 壮观霉素 | 潮霉素,mCherry | / |
pHDE-35S-Cas9-mCherry | CaMV 35S | C-SV40 NLS | 壮观霉素 | 潮霉素,mCherry | / |
pCAMBIA1300-pYAO-cas9 | CaMV 35S, YAO | 3×FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pABS018 | 2×CaMV 35S | 3×FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
ATU6-26-sgRNA-SK | ATU6-26 | / | 氨苄青霉素 | / | / |
pRGEB32 | Ubi | N-3×FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pUC119-gRNA | Lac | / | 氨苄青霉素 | / | / |
pKSE401 | CaMV 35S | 3×FLAG | 卡那霉素 | / | / |
构建目的蛋白与荧光蛋白载体N端或者C端融合的过表达质粒，通过瞬时转化技术或者遗传转化技术，使得该融合蛋白在受体材料细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器中，融合荧光蛋白在扫描共聚焦显微镜的激光照射下发出荧光，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，从而确定目的蛋白的亚细胞定位情况。目前主要用于亚细胞定位的报告基因是绿色荧光蛋白GFP。
| 载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
| pCAMBIA1300-35S-GFP | CaMV35S | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
| pCAMBIA1300-35S-EYFP | CaMV35S | C-YFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
| 16318h-GFP | 2×CaMV35S | GFP | 氨苄青霉素 | / | 可供构建 |
| pCAMBIA1300-ubi-GFP | UBI | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
| pCAMBIA1300-ubi-htpII-ubi-GFP | UBI | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
| pGreenII-62-SK-EGFP | CaMV35S | C-EGFP | 卡那霉素 | / | 可供构建 |
| pCAMBIA1302 | CaMV35S | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
| pCAMBIA1300-mCherry | CaMV35S | C-mCherry | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
| pHBT-GFP-NOS | CaMV35S | C-GFP | 氨苄青霉素 | / | / |
| pUC35s-mCherry | CaMV35S | mCherry | 氨苄青霉素 | / | / |
荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物[4]。其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。在荧光素酶的催化下，荧光素底物可以高效的转变成氧萤光素，同时发出强烈的光。荧光素酶可以高效的检测基因的表达，是检验转录因子与靶目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应，将目的基因启动子转录调控元件可隆至荧光素酶基因的上游，构建成荧光素酶报告质粒，然后转染细胞并裂解，通过测定荧光素酶活性，检测启动子活性。
载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
PCAMBIA1300-EYFP | Lac | EYFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1300-GFP | Lac | GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pGreenII 0800-LUC | CaMV35S | LUC | 卡那霉素 | / | 可供构建 |
pGreenII 0800-miRNA | CaMV35S | Luc | 卡那霉素 | / | 可供构建 |
pSoup | Lac | / | 四环素 | / | / |
pGreenII 62-SK | CaMV 35S | / | 卡那霉素 | / | / |
pmir-GLO | PGK | N-Luc2 | 氨苄青霉素 | / | / |
GUS作为报告基因常用于启动子的活性分析，既可以瞬时表达分析，又能进行稳定遗传实验。将目的基因启动子与GUS融合，可以化学组织染色法对目的基因表达进行定位，也能用荧光定量分析目的基因表达模式。化学组织染色可以了解目的基因在植株不同组织器官的表达，也可以对特定的组织器官染色后做石蜡切片，显微观察目的基因产物在组织细胞中的分布特点。[5]
载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
pCAMBIA1301 | CaMV35S,Lac | GUS,6xHis | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1300-GUS | lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1300-35S-GUS | CaMV 35S | C-GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1381Z | Lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供构建 |
pCAMBIA1391Z | Lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
双分子荧光互补 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)是一项简单直观、能够用于研究体内和体外蛋白质相互作用及目的蛋白在细胞中定位的一种技术。将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光，反之若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。[6]
载体 | 启动子 | 报告基因/标签 | 原核抗性 | 筛选标记 | 备注 |
pUC-SPYNE | CaMV35S | C-myc,YFP-N | 氨苄青霉素 | / | 可供构建 |
pUC-SPYCE | CaMV35S | C-HA,YFP-C | 氨苄青霉素 | / | 可供构建 |
pSPYNE-35S | CaMV35S | C-myc,YFP-N | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pSPYCE-35S | CaMV35S | C-HA,YFP-C | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pSAT1-cEYFP-N1 | CaMV35S | YFP-C | 氨苄青霉素 | / | / |
pSAT1-nEYFP-C1 | CaMV35S | YFP-N | 氨苄青霉素 | / | / |
pSAT4-cEYFP-N1 | CaMV35S | YFP-C | 氨苄青霉素 | / | / |
pSAT4-nEYFP-C1 | CaMV35S | YFP-N | 氨苄青霉素 | / | / |
pSAT6-cEYFP-N1 | 2×CaMV35S | YFP-C | 氨苄青霉素 | / | / |
pSAT6-nEYFP-C1 | 2×CaMV35S | YFP-N | 氨苄青霉素 | / | / |
pSAT6-RFP-N1 | CaMV35S | RFP-N1 | 氨苄青霉素 | / | / |
pSAT6-RFP-C1 | CaMV35S | RFP-C1 | 氨苄青霉素 | / | / |
pEarleyGate201-YN | CaMV35S | HA,YFP-N | 卡那霉素 | / | / |
pEarleyGate202-YC | CaMV35S | FLAG,YFP-C | 卡那霉素 | / | / |
BIFC载体网站：https://www.bio.purdue.edu/people/faculty/gelvin/nsf/protocols_vectors.htm
参考文献
1. 李瑞国. 植物基因工程技术及其发展[J]. 邢台学院学报, 2003,18:83-85
2. 王婷婷等. RNA干扰及其在植物研究中的应用[J]. 生物技术通报, 2013, 3:48-52
3. Marraffini LA et al. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea [J]. Nat Rev Genet, 2010, 11:181-190
4. 杜彦艳等. 报告基因荧光素酶在科研中的应用[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2009, 16: 715-718
5. 杨丹丹等. GUS报告系统在植物基因功能研究中的应用[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2014, 30: 761-768
6. 樊晋宇等. 双分子荧光互补技术[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2008, 24: 764-774
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