技术概述
蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究蛋白间相互作用的一种有效技术手段。转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由其上两个相互独立的结构域，即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)共同完成的。
以Gal4 系统为例，BD和AD 分别由Gal4 蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4 系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即”诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合；只有当BD 与 AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与 GAL UAS结合并且引起报道基因的转录，从而激活下游报告基因，通过这一系列实验来验证两个蛋白之间的相互作用。
技术详情
酵母双杂交系统是一种基于真核生物转录调控机制发展起来的蛋白质相互作用检测技术，由Fields和Song在1989年首次提出。该技术基于真核细胞中转录因子（如GAL4）的结构和功能特点。GAL4有两个互不干扰的结构域，两个结构域在分开时会行驶它们各自的功能，DNA结合域（DNA Binding Domain，BD）具有DNA的结合功能，转录活化结构域（Activation Domain，AD）有激活转录的功能，将两者连在一起会具有转录活性。将待研究的两种蛋白分别与GAL4的BD和AD融合表达，能够形成两种融合蛋白。当这两种蛋白同时转入酵母细胞后，能够在酵母细胞内发生相互作用时，会促使BD与AD在空间上接近，进而激活特定的报告基因，如LacZ、HIS3等，如果两种蛋白没有发生相互作用，报告基因就不会表达。通过检测报告基因的是否表达，可以间接判断两种蛋白之间是否存在相互作用。
膜系统
泛素（ubiquitin）分子量很小，由76aa残基组成，作为信号分子参与到生物泛素化修饰过程，其连接另外一种蛋白质的N端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白降解。泛素可以分成两部分：N端（Nub），C端（Cub）。将泛素Nub的13位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI突变为NubG），避免了Cub和Nub自我结合或接近。将Cub与LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下NubG不与Cub结合，UBPs不能识别分离的泛素，转录激活因子不会被切下来。最后，将要检测的两种蛋白分别与NubG和Cub融合，。当这两种蛋白同时转入酵母细胞后，能够在酵母细胞内发生相互作用时，会促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs识别，导致LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。
典型的实验步骤包括载体构建（如pGADT7-AD和pGBKT7-BD）、酵母转化以及在四缺培养基上进行筛选等。酵母双杂交技术已被广泛用于检测弱相互作用、解析蛋白质互作结构域以及筛选新的互作蛋白，成为蛋白质功能研究中的重要工具。
泛素（ubiquitin）分子量很小，由76aa残基组成，作为信号分子参与到生物泛素化修饰过程，其连接另外一种蛋白质的N端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白降解。泛素可以分成两部分：N端（Nub），C端（Cub）。将泛素Nub的13位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI突变为NubG），避免了Cub和Nub自我结合或接近。将Cub与LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下NubG不与Cub结合，UBPs不能识别分离的泛素，转录激活因子不会被切下来。最后，将要检测的两种蛋白分别与NubG和Cub融合，。当这两种蛋白同时转入酵母细胞后，能够在酵母细胞内发生相互作用时，会促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs识别，导致LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。
典型的实验步骤包括载体构建（如pGADT7-AD和pGBKT7-BD）、酵母转化以及在四缺培养基上进行筛选等。酵母双杂交技术已被广泛用于检测弱相互作用、解析蛋白质互作结构域以及筛选新的互作蛋白，成为蛋白质功能研究中的重要工具。
酵母双杂交系统的主要应用，在于快速分析已知蛋白质间的相互作用，以及筛选与已知蛋白互作的新配体及其编码基因，已经被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导以及药物筛选等多个领域。该技术具备多项显著优势：
（1）其相互作用信号依赖于细胞内重建的转录因子活性，无需繁琐的蛋白质纯化步骤。
（2）检测过程在活细胞中进行，更能反映真实的细胞内环境。
（3）检测结果基于报告基因产物的累积，因此能捕捉微弱或瞬时的相互作用，灵敏度高。
该系统可利用来自不同组织、细胞类型或分化时期的cDNA文库，广泛适用于胞浆、胞核及膜蛋白等多种蛋白的功能研究。
载体构建—制备感受态—转化—点板—互作观察
（聚小编修善编辑）
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如果手上有比较大量的纯度比较高的蛋白质的话。可以尝试用以下比较直接的方法：1. isothermal titration calorimetry （ITC），直接测定两个蛋白互相作用的Kd值。2. AUC，也就是超速离心分析。可以直接测定两个蛋白相互作用与否。3.SAXS, 也就是X-ray小角散乱。不过技术难度比较大一些。4. 溶液NMR，这个应该可以但不太了解。5. 结晶再解构，这个不用解释了。比较究极一点。6.cryo-EM，同上。比较究级的方法。7. 最简单常用的，gel-filtration，观察有没有oligomer的分子量峰出现。但是相互作用弱的话很难观测到。8.更简单常用的nativePAGE，同上，相互作用弱则很难观测到。9.用氨基架桥试剂共价连接，然后SDS-PAGE。看看有没有oligomer的带。暂时想到这些，跨度比较大。