单克隆抗体制备
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
蛋白表达系统有很多种,比较常用的有原核表达系统(大肠杆菌)和真核表达系统(如酵母、昆虫细胞或者哺乳动物细胞)。随着蛋白药物市场的快速发展和蛋白质组学研究的深入,高纯度的活性蛋白的需求量越来越大。
蛋白质因受某些物理或化学因素的影响,分子的空间构象被破坏,从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用(denaturation)。
合成多肽作为目前成本最低抗原肽模拟技术已经在免疫制备抗体行业广泛被接受, 大量被用于模拟制造识别大生物分子的抗体的基本原料, 特别是在制备甲基化抗体, 磷酸化抗体和糖基化抗体方面, 这项技术具有不可比拟的优势。
酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点,已广泛用于外源蛋白的表达, 其优势表现在:1. 表达水平高,既可在胞内表达,又可分泌型表达;
昆虫细胞表达系统是四大表达系统(昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体(Bacmid)上,通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒,
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成:
一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
枯草芽孢杆菌蛋白表达系统,拥有适用于分泌表达及胞内表达的菌株以及对应的多种表达载体,可以满足不同表达需求。孢杆菌分泌的真核来源的重组蛋白具有天然构象和生物活性,避免形成包涵体;表达周期短,蛋白产率高。
重组蛋白纯化主要方法有三种:亲和层析:在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合,这种结合既是特异的,又是可逆的, 亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。利用不同的层析柱,采用亲和层析的原理
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清晰,培养操作简单,转化和转导效率高,生长繁殖快,成本低廉,可快速大规模生产目的蛋白的优点,而且其表达外源基因产物的水平远远高于其他基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法, 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(western blot),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay)(简写ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。